肝脏缺血-再灌注损伤(HIRI)是肝移植及肝切除术后不良预后的核心因素。最新综述揭示,中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)是放大HIRI损伤的关键枢纽,而中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)既是NETs形成的“执行酶”,又是NETs毒性的“核心武器”。
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肝脏缺血-再灌注损伤(HIRI)是肝移植及大范围肝切除术后不良预后的核心决定因素,其中中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)作为连接无菌性炎症、免疫血栓形成与调节性细胞死亡的关键枢纽,已成为该领域的研究热点。2026年5月,山西医科大学附属山西省人民医院消化科汪嵘教授团队在《Biomedicine & Pharmacotherapy》(Q1,IF=7.5)上发表了一篇题为“Targeting neutrophil extracellular traps in liver ischemia-reperfusion injury: From molecular mechanisms to pharmacological and translational opportunities”的综述文章。重点结论如下:
① NETs通过提供免疫血栓形成支架、阻塞肝窦微循环、释放NE、MPO等细胞毒性介质,并放大细胞焦亡(HMGB1-TLR4-NLRP3轴)与以铁依赖性脂质过氧化为特征的铁死亡(ferroptosis)通路,多维加剧HIRI中的微血管及肝细胞损伤;
② 抗NETs治疗需采取分层组合策略,涵盖细胞外支架拆解(DNase)、细胞内NETosis抑制(PAD4/MPO/NE/SYK)、上游无菌性炎症许可信号阻断(HMGB1/IL-33/补体/血小板)及下游损伤执行器调控(焦亡/铁死亡/免疫血栓形成);
③ 机器灌注、复合生物标志物(如MPO-DNA、CitH3)及肝脏定向纳米递送系统是实现阶段特异性、器官限制性抗NET干预的关键转化平台。
该综述系统构建了NETs在HIRI中的致病网络模型,并提出了从分子靶点到临床实施的多层次转化路径,为开发精准抗NETs疗法、改善肝移植及肝脏手术预后提供了重要的理论依据和实践方向。
肝脏缺血-再灌注损伤(HIRI)仍是肝移植、大范围肝切除术及其他涉及无法避免的肝血流中断及随后恢复的临床场景中不良预后的主要决定因素。再灌注并非仅仅逆转缺血性应激,而是迅速将代谢崩溃转化为一种无菌性炎症反应,其特征为肝窦内皮细胞(LSEC)激活、血小板-中性粒细胞交互作用、氧化应激及微循环功能障碍。在此背景下,中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)——由去浓缩染色质为骨架,并装饰有组蛋白和颗粒酶的网络状结构——已不仅仅是中性粒细胞活化的副产物。尽管NETs最初被描述为一种抗菌防御机制,但现在认识到,当其过度产生或清除不充分时,会成为无菌性组织损伤的强效放大器。来自肝外缺血-再灌注模型的证据表明,NETosis是一个跨器官的保守致病程序,受微生物调理、内皮和血小板活化以及氧化还原依赖性信号传导的调控。在肝脏中,NETs尤其有害,因为它们为免疫血栓形成提供了支架,阻塞了窦状微循环,使组织暴露于细胞毒性组蛋白和蛋白酶,并强化了调节性细胞死亡通路。再灌注的肝脏对这一过程尤为敏感,因为从应激的实质细胞和非实质细胞释放的危险信号,在对此类血管内阻塞高度敏感的低压微血管床中,促进了持续的中性粒细胞活化。本综述讨论了HIRI中NETs形成和持续存在的分子调控、NETs加剧肝细胞和微血管损伤的机制,以及NETs靶向干预的药理学和转化医学机遇。
01
引言
HIRI仍是肝移植、扩大肝切除术、创伤手术及移植物保存术后发病的主要原因。尽管在这些情况下暂时中断肝血流常常不可避免,但恢复灌注并非简单地重建稳态。相反,再灌注迅速将缺血性代谢应激转化为一种无菌性炎症反应,其特征为氧化应激、损伤相关分子模式(DAMP)释放、LSEC功能障碍、Kupffer细胞活化、血小板黏附及中性粒细胞募集,最终导致肝细胞损伤和微循环衰竭。这一过程具有重要的临床意义,不仅因为它导致早期移植物功能障碍和术后恢复延迟,还因为它可能影响随后的排斥反应、再生受损及长期预后。 在此过程中日益被牵涉的效应系统中,NETs引起了特别关注。NETs是由活化中性粒细胞释放的细胞外网络状结构,由去浓缩染色质及装饰其上的组蛋白和颗粒蛋白如髓过氧化物酶(MPO)和中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)组成。最初被认为是抗菌防御机制,现在认识到NETs具有高度依赖背景的效应。在生理条件下,它们可以捕获并中和病原体;然而,过度形成或清除不足的NETs可将它们从保护性先天免疫效应器转变为无菌性组织损伤、血栓形成和炎症放大的强效介质。
这种致病性转变在免疫血栓形成和血栓炎症中尤为明显。在严格调控状态下,血管内血栓形成可能作为一种先天防御机制,限制危险信号的播散。然而,当失调时,同样的机制会促进内皮损伤、血小板活化、凝血级联放大和微血管闭塞。NETs已成为这一过程中的核心结构和信号平台,因为它们为血小板黏附和纤维蛋白沉积提供了支架,使组织暴露于细胞外组蛋白和蛋白酶,并维持白细胞募集和炎症信号传导。因此,NETs不应仅被视为炎性碎片,而应被视为连接先天免疫与血栓形成、内皮功能障碍和实质损伤的动态血管内效应器。
这一框架的重要性得到了肝外器官缺血-再灌注损伤研究的强化。近期综述强调,细胞外诱捕网参与了多种组织的缺血-再灌注损伤,并受到先天免疫受体、内皮-血小板相互作用、氧化还原信号及组织特异性基质信号的调控。在肝脏环境中,中性粒细胞现在不仅被认为是募集的炎性细胞,而且是肝脏缺血-再灌注损伤及随后的促肿瘤微环境重塑的主动驱动因素,特别是通过NETs形成和持续存在。
在肝脏中,这一过程尤为严重,因为窦状循环在结构上脆弱,极易被血管内DNA-蛋白质聚集体阻塞。同时,再灌注从应激的肝细胞、内皮细胞和常驻免疫细胞释放大量炎症介质,从而为持续的中性粒细胞活化创造了许可性微环境。实验和转化研究日益表明,LSEC来源的白细胞介素-33(IL-33)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)相关的先天免疫信号,以及中性粒细胞、巨噬细胞和内皮细胞之间的炎症交互作用,均参与了HIRI中NETs的放大。这些观察结果支持这样一个概念:再灌注肝脏中的NETs不是伴随现象,而是将无菌性炎症与微血管功能障碍、调节性细胞死亡和移植物损伤耦合起来的正反馈网络的整合组成部分。
那么,为什么NETs在缺血-再灌注环境中始终如此有害?一个统一的解释是,它们在一个细胞外支架内整合了多种损伤过程。其DNA骨架为血小板黏附和凝血提供了基质;组蛋白充当强效的细胞毒性介质;颗粒来源的酶促进蛋白水解、氧化损伤和内皮功能障碍;而持续存在的NETs物质维持炎症放大。在肝脏中,组织的存活依赖于窦状微循环的完整性以及实质细胞与免疫细胞之间的协调通讯,这些效应可能被放大。这使得NETs成为有吸引力的治疗靶点,但并非简单的靶点。有效的干预可能需要时间精准性、机制选择性和肝脏定向递送,而非不加选择地抑制中性粒细胞功能(图1,表1)。
图1. NETs介导的缺血-再灌注损伤跨器官传播。(左)NETs结构概述。NETs由细胞外DNA为骨架,装饰有组蛋白和颗粒蛋白,包括髓过氧化物酶(MPO)和中性粒细胞弹性蛋白酶(NE),在生理条件下可有助于抗菌防御。(中)在无菌性炎症环境中,DAMPs、血小板和活性氧(ROS)促进NETs积聚、血栓形成、血管闭塞和炎症放大。(右)在肝窦内,血管内NETs沉积损害微循环血流,增强内皮和实质损伤,并伴随炎症介质如高迁移率族蛋白B1(HMGB1)和白细胞介素-33(IL-33)的释放。这些事件加剧局部肝脏损伤,并可能导致远处器官损伤,包括肠道、心脏和肺。缩写:NETs,中性粒细胞胞外诱捕网;MPO,髓过氧化物酶;NE,中性粒细胞弹性蛋白酶;DAMPs,损伤相关分子模式;ROS,活性氧;HMGB1,高迁移率族蛋白B1;IL-33,白细胞介素-33。图片使用BioRender.com创建.
表1 肝外缺血-再灌注损伤中的NETs形成及其与肝脏缺血-再灌注损伤的相关性
02
NETs生物学在肝脏缺血-再灌注损伤背景下的特征
1
NETs结构、释放程序及实验检测指标
NETs是装饰有组蛋白、MPO、NE、组织蛋白酶G(CatG)、抗菌肽及其他颗粒来源介质的细胞外染色质支架。尽管该术语最初指一种独特的抗微生物结构,后续研究已确定NETs释放并非单一统一事件。相反,它涵盖了在上游触发因素、细胞内路径、动力学及对中性粒细胞存活影响方面存在差异的一系列反应。这种区分在无菌性肝损伤中尤为重要,因为NETs形成的生物学意义不能仅从细胞外DNA的存在来推断。相反,关键问题涉及中性粒细胞释放染色质的条件、发生的血管区室以及伴随的蛋白质货物——这些决定了所得支架的生物学活性。
机制上,特征最明确的NETs释放形式涉及氧化爆发、染色质去浓缩、核分叶消失以及DNA-蛋白质复合物的细胞外挤出。经典刺激汇聚于动员ROS、钙流、PAD4以及易位至细胞核并促进染色质松弛的颗粒来源酶的途径。然而,这一框架不再被视为普遍适用。根据刺激背景,NETs形成可能通过与膜破裂相关的溶解性程序进行,或通过更快速的非溶解性释放机制进行,在后一种情况下中性粒细胞至少保留短暂的效应能力。在HIRI中,中性粒细胞并非暴露于单一微生物激动剂,而是暴露于缺氧-复氧应激、DAMPs、活化血小板、补体片段、细胞因子及窦状隙内改变的机械信号这一动态混合物。在此类条件下,肝脏不太可能诱导单一刻板形式的NETosis;相反,它可能支持由微环境时序和多细胞交互作用塑造的多种重叠的释放程序。
这种异质性具有直接的方法学意义。没有单一生物标志物能在体内完全定义NETs形成,特别是在无菌性炎性疾病中,此时细胞外DNA也可能来源于坏死实质细胞。因此,可靠的评估需要一种结合了形态学、共定位和循环替代标志物的复合方法。在组织切片中,细胞外DNA与瓜氨酸化组蛋白H3(CitH3)、MPO或NE的共定位仍是确定空间分辨的NET沉积的最可靠方法。在血浆或血清中,MPO-DNA复合物、NE-DNA复合物、瓜氨酸化组蛋白、核小体和游离DNA(cfDNA)常用,但单独解读时每种均有特异性限制。这一点在HIRI中尤为重要,因为损伤的肝脏本身在再灌注期间是细胞外核酸的主要来源。
从转化医学角度看,NETs持续存在的生物学可能与NETs释放同等重要。一旦形成,这些结构并非惰性。它们的负荷反映了持续产生与内源性脱氧核糖核酸酶(DNases)和其他清除系统酶促清除之间的平衡。血管内NETs物质清除失败会延长组蛋白、蛋白酶、血小板、内皮细胞和补体成分之间的相互作用,从而将短暂的炎症反应转变为自我强化的微血管病变。在肝脏中,循环白细胞紧邻肝窦内皮细胞,管腔暴露于DNA-蛋白质聚集体可能尤为持久。因此,HIRI中的NETs生物学不应被视为存在或不存在的二元事件,而应被视为涵盖启动、释放、血管内沉积、持续和清除的动态过程。
2
为何肝脏缺血-再灌注损伤是一个
易于形成NETs的无菌性炎症微环境
肝脏在缺血-再灌注后独特地易于NETs积聚,因为肝窦的结构和免疫学特征既有利于中性粒细胞活化,也有利于血管内捕获。与高剪切力的动脉床不同,肝窦网络是一个低压、有窗孔的微血管系统,其特征为血流缓慢、白细胞-内皮接触紧密,以及循环先天免疫细胞与实质应激信号之间的密集界面。在缺血期间,三磷酸腺苷耗竭、离子失衡、线粒体功能障碍和内皮损伤建立了一种预启动状态。再灌注则叠加了氧化爆发、钙超载、KC活化、血小板黏附和损伤相关介质的释放,从而精确地产生了已知许可NETs形成的无菌性炎症微环境类型。在此环境中,NETs不仅仅是炎症的下游副产物;相反,它们受到损伤器官的物理和信号传导结构的支持。
一个关键的早期事件是窦状内皮激活。LSECs不是被动的屏障;它们充当感知缺血应激、调节白细胞运输和塑造炎症放大的看门人。再灌注后,它们失去稳态特征,并获得促黏附、血管调节和免疫刺激表型。这种变化促进了中性粒细胞在窦状隙内的募集和滞留,在此处与活化的内皮细胞和血小板的近距离接触降低了NETs释放的阈值。内皮来源的IL-33是将缺血应激与NETs放大联系起来的一个显著信号例子。从受损的LSECs释放的IL-33增强了中性粒细胞募集并促进NETs形成,从而有助于解释为何即使是短暂的缺血发作也可能在再灌注后演变为不成比例的中性粒细胞驱动的损伤。
同时,再灌注的肝脏产生一个富含DAMP的环境,维持中性粒细胞预启动。受损的肝细胞、应激的内皮细胞和活化的KCs释放HMGB1、细胞外DNA、三磷酸腺苷和促炎细胞因子,这些物质通过模式识别通路发出信号并放大无菌性炎症。在移植相关的HIRI中,HMGB1-TLR4信号传导与NETs形成增加和移植物功能较差有关。更新的证据表明,这种炎性微环境通过中性粒细胞和巨噬细胞之间的交互作用进一步稳定,强化了再灌注肝脏不仅仅允许NETs形成,而且是主动指导性的观点。
肝微循环放大了NETs沉积的病理后果。因为窦状隙通畅对于氧气输送、代谢物交换和肝细胞存活至关重要,即使是血管内DNA-组蛋白-蛋白酶复合物的有限积聚也可能产生不成比例的巨大效应。NETs物质减缓窦状血流,强化血小板黏附,促进局部凝血,并延长内皮功能障碍。这有助于解释为何在感染性环境中可能支持宿主防御的相同分子程序,在无菌性肝脏再灌注中变得不成比例地有害。肝脏不仅仅是容纳NETs;它提供了一个血管景观,在其中NETs的沉积几乎立即损害功能。
综合来看,这些考虑为后续章节建立了一个有用的框架。在HIRI中,NETs形成是一种背景依赖性反应,源于内皮警报信号、富含DAMP的无菌性炎症、先天免疫交互作用以及强烈倾向于管腔内滞留DNA-蛋白质支架的窦状微环境。这一框架也具有转化医学意义。如果肝脏在再灌注后本质上是易于形成NETs的,那么有效的治疗可能需要的不仅仅是通用的抗炎抑制。它需要考虑NETs在何处形成、何时持续存在,以及在损伤不同阶段哪些上游信号占主导地位。
03
肝脏缺血-再灌注损伤中NETs形成与持续存在的分子驱动因素
1
无菌性炎症预启动:DAMPs、模式识别通路、
血小板、补体和内皮信号
HIRI中NETs形成的启动最好被理解为一种多组分预启动过程,而非单一的受体驱动事件。再灌注将缺血性代谢应激突然转变为一个危险丰富的炎症微环境,其中受损的肝细胞、活化的窦状内皮细胞、常驻巨噬细胞、血小板和募集的嗜中性粒细胞参与相互的信号放大。因此,中性粒细胞并非孤立活化;相反,它们受一个复合的细胞外程序指导,该程序以DAMPs、内皮警报信号、血管内黏附相互作用和可溶性炎症介质为主,这些共同降低了染色质挤出的阈值,并延长了细胞外诱捕网一旦形成后的持续存在时间。
在这一转变涉及的危险信号中,HMGB1占据中心位置。再灌注后从应激的肝细胞和非实质细胞释放的HMGB1,不仅作为组织损伤的标志物,而且作为无菌性炎症的主动放大器。在移植相关损伤中,HMGB1信号传导与TLR4依赖性的髓系细胞活化及NETs负荷增加有关。因此,HMGB1应被视为更广泛DAMP模块的一部分,该模块通过模式识别通路促进中性粒细胞活化,从而将实质损伤与不断升级的血管内先天免疫反应联系起来。
内皮来源的信号提供了第二层关键的预启动。窦状内皮细胞在战略上定位于将缺血应激转化为募集信号。它们不仅仅是维持再灌注诱导的损伤;它们积极参与白细胞黏附、趋化信号传导以及先天免疫的局部放大。IL-33提供了一个说明性例子。在无菌性肝脏炎症中释放的IL-33,促进中性粒细胞积聚并放大NETs形成,将内皮警报信号置于NETosis上游,并表明窦状内皮有助于确定在再灌注肝脏中NETs在何处及何时产生。同时,内皮功能障碍增加了局部黏附分子的暴露,扰乱了血管张力,并有利于延长中性粒细胞-内皮相互作用,所有这些都增加了预启动的中性粒细胞发生血管内染色质释放的可能性。
血小板代表了该预启动环境的另一个主要决定因素。在无菌性炎性疾病中,血小板-中性粒细胞相互作用日益被认为是血管内NETs形成的关键组织者,特别是在内皮活化和血流紊乱的条件下。在再灌注的肝脏内,血小板早期积聚,与活化的窦状表面结合,并促进白细胞的募集和滞留。它们的贡献超越了简单的黏附。它们提供接触依赖性活化信号,将炎症介质浓缩在窦状隙内,并创建一个促凝支架,在NETs释放后将其稳定。因此,HIRI中的NETs形成应被解释为血小板-内皮-中性粒细胞三联体中的事件,而非孤立的中性粒细胞事件。
补体信号进一步强化了这种预启动状态。缺血-再灌注迅速激活补体级联反应,补体来源的片段促进中性粒细胞募集、内皮活化和血管内炎症。补体最好被视为一种许可性放大器,与DAMP信号、血小板和内皮活化协同作用,以维持易于释放细胞外诱捕网的中性粒细胞表型。即使它不是唯一的触发因素,补体提高了窦状微环境的炎症基调,从而促进了NETs丰富的微血管病变的维持。
与巨噬细胞的交互作用为无菌性预启动增添了另一个维度。最新证据表明,髓系信号回路在再灌注期间不仅仅是共存,而且积极合作以促进NETs形成。巨噬细胞炎症信号增强了中性粒细胞募集,并强化了支持NETosis的炎症微环境。因此,再灌注的肝脏不仅仅是将中性粒细胞暴露于一般的炎症应激;相反,它产生了一个结构化的微环境,其中巨噬细胞、内皮细胞、血小板、DAMPs和补体共同许可和维持NETs形成。这种协调的预启动有助于解释为何HIRI中的NETs沉积通常在空间上集中、时间上持久,并与进行性组织损伤紧密相关。
2
细胞内执行通路:ROS/Ca²⁺/PAD4/NE/MPO及
mtDNA-cGAS-STING信号
一旦中性粒细胞被适当预启动,细胞外诱捕网的释放依赖于一组细胞内执行程序,这些程序重塑染色质、动员颗粒来源的酶,并最终允许DNA-蛋白质挤出。在HIRI中,这些程序受氧化应激、钙信号、代谢重编程以及核和颗粒组分的运输塑造。经典的机制轴线以ROS、钙内流和PAD4介导的组蛋白瓜氨酸化为中心,这些共同促进染色质去浓缩。然而,这一轴线应被理解为模块化的而非严格线性的,根据触发因素、细胞应激状态和再灌注的时间阶段,不同信号占主导地位。
ROS在无菌性NETs形成条件下仍然是主要驱动因素,因为它们整合了线粒体功能障碍、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶活性和炎症受体信号。肝缺血后的复氧精确地创造了这种类型的氧化还原环境。ROS不仅直接损伤细胞大分子,而且作为促进染色质松弛和颗粒动员的信号中间体。钙信号并行作用并与PAD4相交,PAD4的酶活性通过组蛋白瓜氨酸化削弱染色质压缩。在其他器官的缺血-再灌注模型中,PAD4反复成为致病性NETs形成的关键决定因素,支持了PAD4中心调控在肝脏中的合理性。
NE和MPO仍是该网络中的核心效应分子。活化后,NE从嗜天青颗粒易位至细胞核,在其中参与组蛋白降解和染色质松散,而MPO协同重塑核环境并放大氧化反应。这些酶在释放后也保留在细胞外诱捕网上,意味着它们在染色质挤出的上游和下游均发挥作用。在HIRI中,这种双重作用尤为重要。它们参与NETs形成的细胞内机制,并且一旦展示在细胞外支架上,直接导致内皮功能障碍、蛋白水解组织损伤和炎症放大。
脾酪氨酸激酶(SYK)依赖性的代谢和转录重编程是该执行领域的一个较新补充。新证据表明,中性粒细胞中SYK激活促进丙酮酸激酶M2(PKM2)核转位并增强信号转导及转录激活因子3(STAT3)磷酸化,从而在再灌注早期增加NETs产生。这在机制上具有重要意义,因为它将免疫受体相关信号与代谢酶重定位联系起来,并表明无菌性肝损伤中的NETosis受到主动的细胞内重编程支持,而非被动的终末崩溃。它也帮助解释为何再灌注特异性的炎症信号即使在缺乏经典微生物激动剂的情况下也可能转化为持续的NETs输出。
线粒体DNA-环状GMP-AMP合成酶-干扰素基因刺激因子(mtDNA-cGAS-STING)轴通过将细胞外诱捕网生物学与胞质DNA传感和先天免疫反馈联系起来,增加了另一层复杂性。在HIRI中,线粒体损伤和细胞外DNA积聚同时发生,创造了线粒体DNA和NETs来源的DNA均可能充当免疫刺激配体的条件。NETs来源的双链DNA可能被巨噬细胞内化并激活cGAS-STING信号,从而促进炎症性极化并放大组织损伤。尽管NETs来源的DNA与线粒体来源的DNA在体内的相对贡献尚待完全解析,但概念上的进展是明确的:中性粒细胞的染色质释放不仅仅是一个终点,而可能成为邻近免疫细胞中DNA传感通路的次级驱动因素。在再灌注的肝脏中,中性粒细胞和巨噬细胞在近距离积聚,此类信号环路可能促成初始缺血性损伤后无菌性炎症的持续存在。
综合来看,HIRI中NETs的细胞内执行可以被概念化为一个整合的应激程序,涉及氧化还原信号、钙依赖性染色质重塑、PAD4活化、颗粒酶重新分布,以及通过SYK-PKM2-STAT3和DNA传感通路进行的更高阶炎症重编程。这种整合视角比单一路径模型更有用,因为它适应了再灌注应激的异质性,并解释了为何不同的干预措施可能在损伤的不同阶段有效。
04
NETs如何传播肝脏再灌注损伤
1
免疫血栓形成、窦状梗阻及内皮功能障碍
一旦在再灌注的肝脏内形成,NETs便处于有利位置,可将预启动的炎症状态转变为微血管功能障碍。它们在此环境中的致病性不仅取决于其分子组成,也取决于其积聚的部位。在HIRI中,肝窦是关键的血管区室。因为窦状灌注是缓慢、低压且高度依赖于管腔通畅性的,即使是血管内DNA-蛋白质支架的适度沉积也可能产生不成比例的严重功能后果。因此,NETs的功能不如说是作为免疫血栓性损伤的结构组织者,在一个特别容易发生梗阻的血管床内。
免疫血栓形成的概念为理解这一转变提供了最连贯的框架。在受调节的宿主防御中,局部血管内凝血可能有助于控制危险。然而,在再灌注后的无菌性肝脏中,相同的过程变得适应不良。NETs提供了一个细胞外支架,捕获血小板、保留凝血因子并稳定富含纤维蛋白的聚集体。组蛋白、NE、MPO及其他NETs相关蛋白进一步加剧血小板活化和血管炎症,从而有利于中性粒细胞-血小板微血栓的形成。NETs不仅仅是伴随窦状血栓形成;它们帮助构建了血栓发展的基质。
这种血管内支架对窦状生理有几个即时后果。它机械性地增加了血流阻力,特别是在已经狭窄或肿胀的肝窦中。它延长了内皮暴露于蛋白酶、氧化剂和阳离子组蛋白的时间,从而恶化内皮功能障碍。它还创造了一个持续的管腔微环境,支持持续的白细胞募集和黏附。这些效应尤为重要,因为LSECs是缺血-再灌注应激的早期且高度脆弱的靶点。一旦受损,它们失去稳态特性,采用促动脉粥样硬化表型,并变得不太能维持微血管张力和屏障完整性。在此背景下的NETs沉积因此是将早期内皮应激转化为持续性微循环衰竭的一种机制。
NETs与凝血-补体轴之间的反馈增加了另一层损伤。补体激活是肝脏再灌注的一个明确特征,补体来源的介质促进炎性细胞募集、血管通透性和KC活化。NETs通过维持窦状隙内富含白细胞的微病变和稳定血管内炎性病变来强化这一环境。再灌注后微循环不是解决,而是可能陷入持续的的白细胞-血小板-内皮相互作用状态。这有助于解释为何再灌注后肝功能障碍常常比初始缺血性损伤本身所预测的更为严重。
临床意义超出了实验性热缺血。在移植中,缺血性应激因冷保存、内皮活化和同种免疫信号而加剧,NETs驱动的免疫血栓形成可能促成从早期微血管功能障碍到具有临床意义的移植物损伤的转变。尽管NETs依赖性窦状梗阻相对于其他微血管损伤的相对贡献在人类中仍难以量化,但机制上的趋同是令人信服的:再灌注的肝脏提供了一种血管结构,其中血管内NETs积聚足以恶化灌注、放大内皮应激并稳定免疫血栓性病变。
2
直接肝细胞毒性与免疫-微营养素重塑
NETs在HIRI中的损伤效应不仅限于微血管。一旦沉积在肝脏内,NETs还充当高反应性的细胞外平台,直接损伤实质细胞并重塑炎症微环境。其毒性源于结构和内容物。DNA骨架促进了局部滞留,但主要的损伤效应由相关的组蛋白、NE、MPO、CatG和产氧化剂成分介导。在无菌性炎症环境中,这些分子可以破坏细胞膜、降解细胞外基质、改变线粒体功能并加剧氧化还原损伤。在再灌注的肝脏中,肝细胞已经代谢应激且窦状交换受损,此类损伤可能具有放大的后果。
实验观察支持中性粒细胞和NETs相关介质直接参与肝细胞损伤的观点。活化的中性粒细胞可以增加肝细胞死亡并促进额外DAMPs的释放,包括HMGB1和组蛋白,这些反过来又强化炎症信号。这将NETs置于一个自我放大的循环中:肝细胞应激促进中性粒细胞活化,细胞外诱捕网加剧肝细胞损伤,所产生的DAMP负荷进一步增强中性粒细胞反应性。因此,NETs有助于将再灌注损伤从对缺血性应激的时间有限反应转变为一个自我传播的炎症程序。
NETs相关的组蛋白值得特别强调。它们不仅仅是支架的结构成分。一旦暴露于细胞外,它们成为强效的细胞毒性和促炎介质,能够损伤内皮和实质细胞、刺激先天免疫受体并促进血管功能障碍。在肝脏中,实质存活依赖于协调的窦状灌注、线粒体能力和局部免疫约束,富含组蛋白的NETs物质破坏了所有这三者。它延伸了内皮损伤,加重了肝细胞的膜和细胞器应激,并向周围的巨噬细胞和募集的髓系细胞提供了额外的危险信号。
NETs还通过重塑巨噬细胞行为来重塑肝脏免疫微环境。这一维度日益重要,因为再灌注损伤不仅由肝细胞自主性死亡决定,还由先天免疫细胞如何解读和传播局部危险信号决定。NETs可以促进KC促炎性极化并强化DAMP依赖性信号。NETs来源的DNA可能进一步激活巨噬细胞中的DNA传感通路,从而将无菌性炎症延伸到再灌注的初始阶段之后。即使不将所有免疫重塑归因于单一通路,更广泛的原则是明确的:NETs不仅仅是毒性碎片,而是能够重编程巨噬细胞炎症基调的细胞外免疫调节平台。
这种重塑不太可能仅限于巨噬细胞。再灌注的肝脏包含一个密集的多细胞网络,其中KCs、浸润的单核细胞来源的巨噬细胞、窦状内皮细胞、星状细胞和淋巴细胞均对持续性炎症作出反应。一旦沉积,NETs不仅改变靶细胞的活力,而且改变随后损伤或修复展开的炎症决策环境。这可能有助于解释为何再灌注损伤的严重程度不仅与初始缺血的程度相关,而且与血流恢复后炎症回路未解决的程度相关。
综合来看,NETs通过两条紧密相连的途径传播HIRI。它们在肝窦中驱动免疫血栓性功能障碍,并在肝脏内介导直接的实质和免疫调节性损伤。这些途径在机制上可分离但在生物学上趋同。窦状梗阻加重肝细胞应激,肝细胞损伤产生额外的DAMPs,重塑的免疫微环境维持中性粒细胞活化和炎症持续。这种趋同正是使NETs成为HIRI中引人注目的治疗靶点的原因。
05
NETs作为连接炎症与调节性细胞死亡的枢纽
1
NETs驱动的细胞焦亡放大:
HMGB1-TLR4/NLRP3轴
一个重要的近期进展是认识到NETs不仅仅是伴随炎症性组织损伤;它们可以主动地将细胞外先天免疫激活与细胞内死亡执行耦合。在HIRI中,这种耦合与细胞焦亡尤其相关,细胞焦亡是一种溶解性炎性细胞死亡程序,由炎症小体激活、炎性半胱天冬酶、gasdermin D孔形成及免疫刺激介质的释放驱动。细胞焦亡提供了无菌性炎症自我放大的细胞内机制,而NETs提供了帮助维持和空间组织炎症微环境的细胞外支架。因此,它们的相互作用具有生物学意义,而非偶然。
HMGB1-TLR4轴提供了NETs丰富的微环境可能转化为细胞焦亡信号的最明确途径之一。HMGB1在再灌注肝组织中含量丰富,并且已被确定为肝脏无菌性炎症的主要介质。它也处于连接细胞外危险信号与炎症小体预启动的有利位置,因为TLR4-核因子κB(NF-κB)激活促进了NLRP3和pro-IL-1β的转录许可,从而使细胞对次级激活信号敏感。在HIRI中,缺血性实质应激和NETs相关的组织损伤增加了局部HMGB1负荷,而表达TLR4的巨噬细胞、内皮细胞以及可能的实质靶细胞保持准备将该信号转化为炎症小体准备状态。因此,HMGB1不应仅被视为平行的炎症标志物,而应被视为连接NET丰富的无菌性损伤与细胞焦亡能力的分子翻译器。
NLRP3似乎是该回路内的主要下游节点。越来越多的证据支持NLRP3炎症小体激活是炎症性肝细胞损伤和免疫失调的核心决定因素。NETs可以诱导肝脏血管细胞中的细胞焦亡程序并加剧肝内凝血,表明NETs驱动的细胞焦亡不仅限于实质细胞,也可能涉及对微循环衰竭至关重要的内皮靶点。这一点尤为重要,因为它将细胞外诱捕网生物学直接与一种能够恶化血管和炎症表型的细胞死亡通路联系起来。
在再灌注的肝脏中,最合理的细胞焦亡回路因此是分层而非线性的。初始缺血性应激释放HMGB1和其他DAMPs,启动TLR4依赖性的炎症信号。募集的嗜中性粒细胞在窦状和窦周微环境中沉积NETs,添加细胞外组蛋白、蛋白酶、DNA和进一步的DAMP放大。这些信号随后有利于巨噬细胞、内皮细胞以及可能的应激肝细胞中的NLRP3激活,导致gasdermin D依赖性的膜通透化、IL-1β释放和进一步的白细胞募集。一旦建立,细胞焦亡不再仅仅是损伤下游的终末事件;相反,它成为额外细胞外炎症信号的来源,这些信号强化NETosis并维持免疫血栓性功能障碍。
从综述的角度看,区分机制合理性与证据成熟度很重要。在HIRI中完全解析的NETs-HMGB1-TLR4-NLRP3轴的直接证据仍不完整。然而,该回路的组成部分得到了强有力的支持:HMGB1在肝脏再灌注中具有致病性,TLR4信号放大无菌性肝脏炎症,NLRP3介导的细胞焦亡参与损伤,并且NETs可以诱导肝脏血管细胞中的细胞焦亡信号。综合来看,这些发现证明了将NETs驱动的细胞焦亡放大构建为HIRI中的一个核心致病模块是合理的,同时仍承认细胞类型特异性、时间层级以及内皮细胞与巨噬细胞细胞焦亡的相对贡献需要进一步阐明。
这一框架对干预具有实际意义。如果NETs参与细胞焦亡放大而不仅仅是与之共存,那么结合NETs拆解或阻断NETs形成与炎症小体调节的治疗策略可能在机制上优于单独使用任何一种方法。它还表明,整合NETs相关标志物与细胞焦亡相关细胞因子的生物标志物组合可能比单独任一类标志物更好地捕获活动性疾病传播。
2
NETs驱动的铁死亡重塑:氧化还原崩溃、
铁过载及时空耦合
如果说细胞焦亡代表了HIRI中调节性细胞死亡的炎症性溶解臂,那么铁死亡则代表了其代谢-氧化还原对应物。铁死亡是一种铁依赖性的细胞死亡形式,其特征为灾难性脂质过氧化、抗氧化防御崩溃以及由氧化磷脂驱动的膜损伤。在器官缺血-再灌注环境中,铁死亡日益被认为是再灌注损伤的一个显著效应机制,尤其是在线粒体功能障碍、氧化爆发和铁失衡同时发生的组织中。肝脏满足所有这些条件:它代谢活跃、富含线粒体,并在再灌注期间直接暴露于炎症性铁和氧化剂通量。
NETs处于有利位置以加剧这种铁死亡环境,即使它们并不总是初始触发因素。它们的贡献最好被理解为一种重塑功能:它们改变氧化还原和炎症景观,从而降低周围细胞发生铁死亡的阈值。NETs形成与氧化爆发紧密相关,而NETs相关的MPO和其他颗粒来源的酶在释放后传播局部氧化剂应激。组蛋白和蛋白酶加重膜损伤和线粒体功能障碍。持续的NETs沉积延长了白细胞募集和巨噬细胞激活,从而维持了富含ROS、炎症细胞因子和铁动员信号的组织环境。NETs因此创造了铁死亡损伤更易触发、更难解决且更可能在再灌注微环境中扩散的条件。
这种解释在HIRI中尤为相关,因为再灌注本身已经施加了强烈的铁死亡倾向。线粒体损伤、谷胱甘肽耗竭、胱氨酸代谢紊乱和不稳定铁积聚均是缺血后肝脏生物学上合理的特征。在此背景下,NETs可能不作为孤立的触发因素,而是作为细胞外加速剂,放大脂质过氧化,将氧化损伤扩展到邻近的血管和实质细胞,并强化破坏氧化还原稳态的炎症回路。这种表述避免了夸大证据,同时捕捉了NETs作为铁死亡应激倍增器的可能致病作用。
NETs与铁死亡之间的关系也可能是时间结构化的。细胞焦亡和铁死亡通常作为调节性细胞死亡的平行形式被讨论,但在再灌注生物学中,它们可能是部分顺序性和相互强化的。再灌注早期,NETs形成和炎症小体相关信号可能主导炎症反应,尤其是在白细胞募集最强烈的窦状区室中。随着氧化损伤积累、线粒体功能障碍加重和抗氧化缓冲能力下降,铁死亡程序在肝细胞和血管细胞中可能变得越来越显著。在此情景中,NETs充当了早期炎症点燃与后期氧化还原崩溃之间的桥梁。
mtDNA-cGAS-STING通路可能提供NETs驱动的炎症与铁死亡重塑之间的另一个汇聚点。DNA传感通路日益被牵涉于无菌性炎症和调节性细胞死亡中,HIRI中丰富的胞质和细胞外DNA可能有助于稳定炎症和氧化回路,而不仅仅是记录初始损伤。尽管NETs来源的DNA通过cGAS-STING对铁死亡的直接贡献尚待确证,但概念上的重叠是令人信服的:NETs持续、线粒体损伤和铁死亡易感性均在相同的氧化还原-炎症微环境中加剧。
铁死亡在本综述中重要的另一个原因是它强化了NETs靶向的治疗理由。如果NETs参与维持铁死亡许可性而不仅仅是反映炎症严重程度,拆解细胞外诱捕网可能影响的不止是白细胞行为或血栓形成。它还可能改变受损肝脏的氧化还原结构。这种可能性很有吸引力,因为传统的抗炎策略常常无法解决脂质过氧化和铁依赖性膜损伤。相比之下,将NETs控制与铁死亡调节联系起来的框架支持多靶点干预,例如通过DNase基础策略、PAD4或颗粒酶抑制,以及铁死亡导向的抗氧化剂或铁处理调节剂的组合。
综合来看,当前证据支持一个模型,在该模型中NETs充当HIRI中调节性细胞死亡的核心组织者。它们通过增强HMGB1-TLR4-NLRP3信号来放大细胞焦亡回路,并通过持续的氧化剂应激、蛋白酶暴露、内皮损伤和炎症持续将再灌注的肝脏重塑为易于发生铁死亡的环境。这些死亡途径在机制上是不同的,但在受损的肝脏中它们不太可能孤立运作(图2)。
图2. NETs驱动的肝脏缺血-再灌注损伤机制。(左)上游预启动和NETs形成。缺氧/复氧(H/R)应激激活LSECs、Kupffer细胞、血小板和受损肝细胞,导致DAMPs释放,包括HMGB1和IL-33。这些信号接合Toll样受体4(TLR4)并促进活性氧(ROS)产生、Ca²⁺内流、PAD4激活、染色质去浓缩以及含有髓过氧化物酶(MPO)和中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)的NETs释放。(右上)免疫血栓形成和窦状功能障碍。NETs为富含血小板的微血栓、纤维蛋白沉积、补体激活、内皮屏障损伤、窦状隙狭窄和血流减少提供支架。(右下)调节性细胞死亡和实质损伤。NETs相关信号放大NLRP3依赖性细胞焦亡和ROS驱动的铁死亡,从而加重肝细胞损伤和肝功能障碍。缩写:NETs,中性粒细胞胞外诱捕网;H/R,缺氧/复氧;LSECs,肝窦内皮细胞;DAMPs,损伤相关分子模式;HMGB1,高迁移率族蛋白B1;IL-33,白细胞介素-33;TLR4,Toll样受体4;ROS,活性氧;PAD4,肽基精氨酸脱亚氨酶4;MPO,髓过氧化物酶;NE,中性粒细胞弹性蛋白酶;vWF,血管性血友病因子;NLRP3,含NOD样受体家族pyrin结构域蛋白3;GSDMD,gasdermin D;GPX4,谷胱甘肽过氧化物酶4。图片使用BioRender.com创建。
06
靶向NETs:药理学策略与转化医学机遇
在HIRI中,NETs病理学跨越四个药理学上不同的层面进行组织:细胞外NETs支架本身;使得染色质释放成为可能的细胞内酶学机制;使肝窦易于形成NETs的上游无菌性炎症许可网络;以及将NETs持续转化为内皮衰竭、免疫血栓形成、细胞焦亡、铁死亡重塑和移植物功能障碍的下游损伤偶联模块。以此方式构建本节是重要的,因为NETs不代表单一靶点,而是由结构元件、催化效应器、受体介导信号和组织背景放大器组成的多尺度药理学系统。
1
定义NETs驱动的HIRI的可成药架构
从药理学角度看,NETs最具可操作性的特征在于它们既包含物理支架,也包含生化有效载荷。DNA-组蛋白骨架可直接被核酸酶靶向;组蛋白和DNA-蛋白质聚集体构成血管毒性表面;MPO和NE充当氧化和蛋白水解损伤的酶学放大器;PAD4充当染色质浓缩的看门人;而ROS敏感性信号将线粒体功能障碍与NETs释放联系起来。同时,肝脏缺血-再灌注微环境通过HMGB1-TLR4/TLR9信号、IL-33/ST2内皮警报信号、补体驱动的放大、血小板-中性粒细胞黏附以及最新描述的SYK-PKM2-STAT3中性粒细胞免疫代谢编程提供了另一层可处理性。综合来看,这些特征使NET驱动的HIRI特别适合基于节点的药理学策略,而非单一药物方法。
这种架构也允许进行优先级排序。一些靶点作用于细胞外且可立即操作,例如DNase介导的支架拆解。其他是细胞内执行节点,包括PAD4、MPO、NE和SYK。第三类包含无菌性炎症许可信号——HMGB1、TLR4、TLR9、IL-33、补体和血小板——这些信号决定了再灌注窦状隙中的中性粒细胞是否跨越从活化到NETosis的阈值。最后,第四类包括NET耦合的损伤执行器,尤其是NLRP3依赖性细胞焦亡、氧化还原依赖性铁死亡重塑以及凝血-补体介导的微血管崩溃。其转化医学含义是直接的:最优的抗NET策略将较少取决于靶点的抽象流行度,而更多取决于在再灌注的特定阶段哪一层在生物学上占主导地位。
2
细胞外拆解与中和:最直接的抗NETs策略
最直观的干预仍然是直接的NETs拆解,因为它作用于病变的决定性结构特征而非中性粒细胞存活。基于DNase的治疗至少因三个原因而具有吸引力。首先,它直接降解稳定血小板黏附、纤维蛋白滞留和窦状梗阻的细胞外DNA骨架。其次,它可能通过瓦解展示组蛋白和颗粒来源酶的基质,缩短这些物质在血管内的滞留时间。第三,它在概念上与肝脏定向递送策略兼容,包括离体灌注和纳米颗粒赋能方法。在以NET为中心的疾病模型中,DNase仍然是支架本身可成药的最明确证据。然而,其局限性同样重要:可溶性DNase体内半衰期短,其酶活性在高度炎症性环境中可能减弱,且支架裂解不能自动中和所有释放的组蛋白或蛋白酶。在HIRI中,DNase因此应被视为一种入门级疗法,而非完整解决方案。
这一概念的更先进配方正从纳米医学中浮现。最近一种DNase I介导的趋化纳米颗粒被设计用于利用NETs的血管定位来实现病变定向积聚和局部微环境的协同调节。尽管该研究是在缺血性卒中而非肝脏缺血-再灌注损伤中开发,其设计原理高度可移植至HIRI,因为两种场景均以受损内皮床内的血管内NETs沉积为特征。此类平台与肝脏再灌注尤其相关,因为它解决了游离DNase的主要转化医学限制——较差的滞留时间和不充分的定位——同时保留了细胞外支架拆解的概念简洁性。在肝移植背景下,若在离体灌注期间部署此类系统可能特别有吸引力,因为组织暴露和剂量可以在没有全身性免疫抑制溢出风险的情况下进行控制。
一个相关但尚未充分发展的策略是在支架分解后中和NETs的毒性生化有效载荷。即使DNA框架已被降解,组蛋白、MPO和NE仍然具有致病性。这就是为何细胞外拆解在与有效载荷抑制配对时最有效——例如DNase加NE抑制、DNase加MPO导向的氧化还原缓冲,或DNase加内皮保护性抗凝策略。对于一个以药理学为导向的期刊,这一点值得强调:支架是NETs生物学中最可见的组成部分,但药理学上相关的病变实际上是一个DNA-组蛋白-蛋白酶复合物。治疗设计应反映这种复合物性质。
3
抑制NETs释放:PAD4、MPO、NE、ROS和
SYK作为核心细胞内靶点
如果说DNase代表了最直接的细胞外策略,那么PAD4仍是最经典的NETosis细胞内靶点。通过催化组蛋白瓜氨酸化和削弱染色质压缩,PAD4在炎症信号与物理染色质释放之间占据了一个特权位置。这不仅使其具有吸引力,因为它位于支架形成上游,还因为它在将活化的中性粒细胞与释放诱捕网的中性粒细胞区分开来的特定结构检查点发挥作用。在实际操作中,PAD4抑制有可能减少微血管阻塞和有毒NETs内容物的暴露。主要警告是背景依赖性:PAD4对许多NETs程序至关重要,但并非所有NETs释放都严格以PAD4为主导。在HIRI中,PAD4因此应被视为一个高优先级靶点,理想情况下是在阶段和机制感知的框架内,而非作为通用的抗NET解决方案。
MPO和NE构成了第二大类细胞内效应器。MPO参与氧化放大,既作为执行酶又作为滞留的细胞外毒性货物发挥作用。NE有助于组蛋白加工、染色质松散和释放后的蛋白水解损伤。这些特性使MPO和NE从生物化学药理学角度来看特别有吸引力,因为它们位于NETs产生和NETs毒性之间的界面。因此,抑制任一种酶可能不仅仅是抑制诱捕网释放;它还可能削弱确实形成的NETs的损伤表型。这种双重杠杆作用在HIRI中概念上很有吸引力,因为内皮和肝细胞暴露于富含MPO/NE的支架可能与释放的DNA绝对量同等重要。
ROS导向的策略值得特别关注,因为氧化还原应激不仅仅是HIRI中的背景事件,而是其主导的生物化学货币之一。活性氧位于NETs形成上游、MPO活性下游,与线粒体功能障碍紧密相关,并与铁死亡许可性紧密耦合。这使得ROS调节成为少数几种能够同时重塑NETosis倾向、微血管毒性以及NETs与调节性细胞死亡耦合的干预措施之一。近期的HIRI综述和药物递送研究日益将ROS视为核心治疗轴,支持抗氧化药理学、氧化还原活性纳米材料和酶模拟清除剂可能特别适合作为NETs调节辅助剂,而不仅仅是通用的肝保护剂。
在较新的细胞内靶点中,SYK-PKM2-STAT3轴是机制上最引人注目的之一。一项在肝脏缺血-再灌注损伤中的研究表明,SYK激活促进中性粒细胞中PKM2核转位和STAT3磷酸化,从而增加NETs形成并加剧肝损伤。这一发现很重要,因为它将抗NETs药理学超越了经典的酶抑制,进入了免疫代谢重编程领域。SYK不仅仅是另一种上游激酶;它是一个汇聚节点,将再灌注相关的炎症信号转化为持续的NETs输出。对于一本强调分子药理学的期刊,这条通路值得明确突出,因为它代表了一个更现代的靶标类别——NETs能力的信号转导控制——而非仅仅是结构或酶学阻断。
4
靶向无菌性炎症许可:HMGB1、IL-33、补体、
血小板和NET-STING信号
该领域的一个关键概念性进展是,HIRI不应被视为中性粒细胞自发过度反应的状态;相反,受损的肝脏通过一系列细胞外信号主动许可NETs形成。这使得上游炎症回路具有可成药性,即使干预并非NETs专属。其中,HMGB1可以说是价值最高的靶点。肝移植中的转化医学工作表明,二硫键HMGB1在具有组织病理学缺血-再灌注损伤的移植物中富集,并通过TLR4和TLR9信号传导来放大巨噬细胞炎症程序。这与抗NETs治疗高度相关,因为HMGB1位于实质应激、先天免疫激活和中性粒细胞预启动的交界处。靶向HMGB1,或其所作用的受体逻辑,提供了一种抑制使再灌注肝脏易于形成NETs的微环境许可性的手段。
IL-33/ST2是第二个高优先级许可通路,特别值得注意,因为它将内皮生物学与NETs放大联系起来。在实验性肝脏缺血-再灌注损伤中,从肝窦内皮细胞释放的IL-33放大了NETs形成和无菌性炎症损伤。这使得IL-33/ST2在概念上区别于HMGB1:HMGB1作为一个广泛的DAMP放大器,而IL-33直接将内皮识别为NETs倾向行为的主动生成器。在药理学框架内,IL-33/ST2靶向具有吸引力,因为它靠近HIRI相关NETosis的空间起源,即再灌注的肝窦。
补体和血小板-中性粒细胞相互作用形成了第三个许可轴。补体激活是肝脏缺血-再灌注损伤的一个公认驱动因素,当前综述强调补体靶向干预是新兴的治疗策略。血小板驱动的白细胞募集和NETs丰富的血栓炎症性病变的血管内稳定使血小板-中性粒细胞交互作用成为另一个可操作层面。这些途径可能不是NETs特异性的,但这并非弱点;这是它们转化医学吸引力的一部分。在HIRI中,表现最佳的治疗可能正是那些间接减少NETosis,同时同步减弱平行损伤流如内皮激活、凝血和白细胞滞留的治疗。
这一主题的一个尤其前瞻性的延伸是移植后NETs来源DNA的传感。一项近期研究报道,NETs激活STING信号以驱动肝移植后树突状细胞成熟和排斥反应。尽管这项工作涉及同种免疫损伤而非经典的热缺血-再灌注损伤,它通过显示NETs DNA不仅是一个血栓形成支架,而且是一个具有受体特异性下游后果的免疫活性核酸货物,拓宽了抗NETs治疗的转化医学视野。这一发现强烈支持一个未来的治疗模型,其中NETs控制与STING轴调节整合在一起,特别是在缺血-再灌注损伤和同种免疫重叠的移植环境中(表2)。
表2 NETs驱动的肝脏缺血-再灌注损伤的可成药靶点与转化策略
5
组合药理学:将NETs与细胞焦亡、铁死亡和
免疫血栓形成解偶联
从近期工作中浮现的最有说服力的治疗原则是,抗NETs治疗应被设计为组合架构,而非单一疗法的教条。NETs通过至少三个下游损伤执行器加剧HIRI:窦状免疫血栓形成、炎症小体驱动的细胞焦亡和氧化还原-铁依赖性的铁死亡重塑。这意味着即使是非常有效的抗NETs干预,如果仅在内皮崩溃、血小板丰富闭塞、线粒体损伤和死亡信号完全建立后才应用,也可能表现不佳。反之亦然:阻断细胞焦亡或铁死亡而不减少持续的NETs产生,可能仅仅是修剪下游分支而保留上游驱动因素。因此,组合逻辑不是可选的;它在生物学上是连贯的。
在实际操作中,三种组合策略显得特别有力。第一种是DNase加有效载荷或下游抑制,例如DNase联合NE/MPO抑制或联合内皮保护性抗血栓策略。第二种是NETosis阻断加炎症小体控制,尤其是在HMGB1-TLR4-NLRP3信号占主导的环境中。第三种是NETs调节加氧化还原或铁死亡控制,这尤其有吸引力,因为ROS既在NETs释放上游发挥作用,也在NETs介导的组织重塑下游发挥作用。一项研究表明,血小板加速脂质过氧化并诱导致病性NETosis,而抑制脂质过氧化在体内抑制NETosis。尽管这不是一项肝脏缺血-再灌注研究,它为在HIRI中将抗NETs治疗与抗脂质过氧化方法耦合提供了显著的生物化学理由。
这种阶段适应的组合框架特别适合HIRI。在再灌注早期,上游许可阻断和细胞内NETosis抑制可能提供最大的杠杆作用。一旦NETs丰富的血管内病变建立,细胞外拆解变得更加相关。在后期,当组织表型以持续性血栓形成、细胞焦亡细胞因子环路和铁死亡崩溃为主导时,最优策略可能是混合疗法而非靶点纯粹主义。这是最可能与寻求药理学深度而非描述性完整性的编辑产生共鸣的信息。
6
转化医学实施:生物标志物、机器灌注和
肝脏定向纳米医学
要使NETs靶向治疗从机制走向干预,必须配套解决三个实际问题的工具:治疗谁、何时治疗以及如何递送治疗而不产生过度的全身性风险。因此,生物标志物开发应被构建为治疗设计的一部分,而非作为事后考虑的独立诊断。在肝脏机器灌注和移植后早期损伤期间,转录组学和灌注液生物标志物研究日益寻求识别与移植物质量和早期移植物功能障碍相关的特征。在此框架内,NETs相关的读数——包括MPO-DNA复合物、瓜氨酸化组蛋白、cfDNA模式、DAMP谱以及潜在的mtDNA富集特征——具有吸引力,因为它们可能反映活跃的血管内炎症性损伤,而非非特异性的肝细胞坏死。关键点是特异性:一个有用的转化医学组合可能需要是基于多种分析物的复合物,而非单一分析物。
机器灌注目前是肝移植中抗NETs治疗最强的转化医学平台。低温氧合灌注和常温机器灌注不再仅仅是保存工具;它们正成为受控移植物复苏、分子评估和局部治疗的可干预平台。这对于NETs导向治疗尤为相关,因为它有助于解决治疗指数问题。DNase、PAD4抑制剂、MPO/NE抑制剂、氧化还原活性化合物或STING/HMGB1导向的药物原则上可以在灌注期间直接递送至移植物,从而最大限度地减少全身暴露,同时允许实时监测血流、损伤生物标志物、代谢恢复和炎症输出。这种器官限制性剂量逻辑可能比在免疫抑制受者中立即进行全身性抗NETs治疗在临床上更具可行性。
第三个实施支柱是肝脏定向纳米医学,该领域正在快速发展。一篇关于HIRI新兴纳米和微米药物递送系统的近期综述强调了靶向载体、控释和多功能设计如何开始汇聚于氧化应激、炎症、内皮损伤和代谢功能障碍。更直接地,一项研究描述了负载二甲双胍的中性粒细胞模拟普鲁士蓝纳米酶,靶向肝脏中的炎症性缺血-再灌注区域,并通过协同免疫代谢控制减轻HIRI。这种策略在狭义上并非经典的抗NETs药物,但高度相关,因为它证明了在正是所关注的疾病背景下,炎症归巢、肝脏定向、多机制纳米疗法的可行性。对于以药理学为重点的综述,这是最值得包括的前瞻性例子之一。
综合来看,NETs靶向治疗在HIRI中最可信的未来不太可能来自单一优越分子。相反,它将来自一个分层的转化医学策略:细胞外诱捕网拆解或选择性NETosis阻断,结合上游许可控制和下游损伤解偶联,通过机器灌注实施,以复合生物标志物为指导,并日益由肝脏靶向载体赋能(图3)。正是在这个整合框架内,药理学可处理性、机制精确性和临床实用性开始趋于一致(表3)。
图3. NETs靶向治疗在肝脏缺血-再灌注损伤中的可成药架构与转化医学实施。(左)在HIRI中,中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)与富含血小板的病变一起在肝窦内积聚,而受损的肝细胞和巨噬细胞放大局部应激和炎症信号。(中)该病变可被药理学解构为不同的可成药层面,包括通过DNase进行细胞外支架拆解、抑制细胞内NETsosis介质如PAD4、MPO、NE和SYK、抑制无菌性炎症许可信号如HMGB1、IL-33、TLR4、补体和血小板,以及阻断下游损伤模块包括NLRP3、铁依赖性氧化损伤、STING信号和血栓形成。(右)转化医学工具的整合,包括机器灌注、生物标志物引导的时机选择和肝脏定向纳米递送,可能实现精准干预、改善移植物灌注并优化临床结局。缩写:HIRI,肝脏缺血-再灌注损伤;NETs,中性粒细胞胞外诱捕网;DNase,脱氧核糖核酸酶;PAD4,肽基精氨酸脱亚氨酶4;MPO,髓过氧化物酶;NE,中性粒细胞弹性蛋白酶;SYK,脾酪氨酸激酶;HMGB1,高迁移率族蛋白B1;IL-33,白细胞介素-33;TLR4,Toll样受体4;NLRP3,含NOD样受体家族pyrin结构域蛋白3;STING,干扰素基因刺激因子。图片使用BioRender.com创建。
表3 NETs靶向策略在肝脏缺血-再灌注损伤中的阶段适应性实施
07
结论
NETs已成为HIRI中的核心致病效应器,而非中性粒细胞活化的次级副产物。其重要性在于它们能够将多层损伤整合为一个单一的自我强化网络。它们在一个本质上允许血管内滞留的窦状微环境中产生,被DAMP驱动的无菌性炎症放大,被血小板-内皮交互作用和补体活性稳定,并通过免疫血栓形成、内皮功能障碍、肝细胞毒性和调节性细胞死亡转化为组织损伤。从这个意义上说,NETs在血管、炎症和实质损伤的界面上占据了一个战略位置。
从当前文献中浮现的一个核心概念是,NETs不应与再灌注肝脏的更广泛损伤架构分离看待。它们的致病性正是因为它们将上游炎症预启动与下游损伤执行连接起来而被放大。它们通过组织窦状免疫血栓形成来传播微循环崩溃,通过持续的巨噬细胞和内皮活化来加剧无菌性炎症,并帮助将细胞外危险信号耦合到细胞焦亡和铁死亡损伤程序。这种整合作用解释了为何靶向NETs具有潜在吸引力,但在生物学上也是要求很高的。有效的干预可能需要的不只是简单的中性粒细胞抑制。相反,它需要阶段敏感、机制知情的策略,能够区分早期预启动、活跃支架形成以及以调节性细胞死亡和微血管衰竭为主的后期阶段。
从药理学角度看,最有希望的未来不太可能来自任何一种统一使用的单一抗NETs药物。相反,进展可能取决于分层治疗设计。直接拆解细胞外诱捕网、抑制细胞内执行机制、调节上游炎症许可,以及与靶向细胞焦亡、铁死亡或免疫血栓形成的疗法进行合理组合,均在更广泛的干预框架中占有一席之地。它们的相对价值将取决于时机、组织区室和疾病背景。这在肝移植中尤为重要,因为疗效必须与维持全身宿主防御相平衡。
转化医学前景日益看好,因为若干赋能发展正在汇聚。复合生物标志物策略可能有助于识别活跃的NETs驱动损伤并定义治疗窗口。机器灌注为植入前抗NETs疗法的器官限制性测试和递送提供了一个独特平台。先进的肝脏定向载体系统提供了一种改善暴露、减少全身毒性和支持多功能干预的现实手段。这些进展共同表明,HIRI中的NET靶向正在从描述性免疫病理学向更精确的治疗学科迈进。
若干挑战仍然存在。再灌注肝脏中不同NETs释放程序的相对贡献仍未完全阐明。下游细胞焦亡和铁死亡回路中的细胞类型特异性需要进一步澄清。识别人类移植物损伤中可操作的NETs生物学的最佳生物标志物仍未确定,且临床相关的治疗窗口需要更精确地绘制。尽管如此,该领域已取得足够进展,足以证明一个明确的概念转变是合理的:NETs现在不仅应被视为炎症的生物标志物,而且应被视为肝脏灌注损伤的可操作枢纽。完善如何、何时以及在何处靶向它们,可能为保护肝脏免受缺血-再灌注损伤开辟一条新的药理学途径。
参考文献:
An P, An Y, Chen M, Wu L, Wang R. Targeting neutrophil extracellular traps in liver ischemia-reperfusion injury: From molecular mechanisms to pharmacological and translational opportunities. Biomed Pharmacother. 2026 May;198:119322. doi: 10.1016/j.biopha.2026.119322. Epub 2026 Apr 3. PMID: 41934899.
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