·论 著 ·环磷酸腺苷增强免疫力作用的研究
Effects of cAMP on immunological function enhancement
王永群 1，邱琳 2，马颀 3
WANG Yong-qun1，QIU Lin2，MA Qi3
1.天津津乐康科技有限公司，天津 300000；2.天津市疾病预防控制中心毒理室， 天津 300011；3.天津职业大学，天津 300402
摘要：目的 观察环磷酸腺苷对增强小鼠免疫功能的影响。方法 将 160 只雌性昆明种小鼠随机分为 4 组，分别是环磷酸腺苷低剂量组（0.42 mg/kg）、中剂量组（1.28 mg/kg）、高剂量组（3.84 mg/kg）和对照组，每日 1 次，连续给药 30 d。分别观察环磷酸腺苷对刀豆素 A（ConA）诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖功能、绵羊红细胞诱导的小鼠迟发型变态反应（DTH）、血清溶血素、抗体生成细胞、NK 细胞活力的影响。结果 小鼠碳廓清试验显示，中、高剂量组的吞噬指数显著高于对照组（P＜0.05）；小鼠半数溶血值（HC50）影响试验显示，中、高剂量组的 HC50 显著高于对照组（P＜0.05）；小鼠脾淋巴细胞转化试验显示， 高剂量组吸光度值显著高于对照组（P＜0.05）；其他各项试验未见免疫抑制现象。结论 补充环磷酸腺苷有助于增强小鼠的免疫功能。
关键词：环磷酸腺苷；小鼠；免疫功能
中国图书资料分类号：R-332 文献标识码：A 文章编号：1004-1257（2017）08-1054-04
DOI:10.13329/j.cnki.zyyjk.2017.0326
Effects of cAMP on immunological function enhancement
WANG Yong-qun1，QIU Lin2，MA Qi3
1.Tianjin Jinlekang Technology and Technology Ltd.，Tianjin，300000 ，China ；2.Toxicology Department ， Tianjin Centers for Disease Control and Prevention，Tianjin，300011，China；3.Tianjin Vocational Institute，Tianjin，300402，China
Abstract：［Objective］To observe the effects of Cyclic adenosine monophosphate （cAMP）on the immunological function of mice. ［Methods］a total of 160 mice were randomly divided into 4groups：low dose group（0.42 mg/kg），middle dose group（1.28 mg/kg） and high dose group（3.84 mg/kg）of cAMP and control group，successive administration was conducted for 30 d，once daily. The proliferative function of lymphocyte induced by ConA，delayed type hypersensitivity （DTH）induced by SRBC，serum hemolysin， antibody forming-cells and NK activity were observed.［Results］Mice carbon clearance test showed the phagocytic index of high and middle dose groups was significantly higher than that of the control group （P＜0.05）. HC50 test showed HC50 of high and middle groups was significantly higher than the control group （P＜0.05）. Transformation test of spleen lymphocyte showed suction light density of high dose group was significantly higher than that of control group （P＜0.05）. Immunosuppressive phenomena did not showed in other tests.［Conclusion］Supplementary cAMP could significantly improve the immunological function of mice.
Key words：Cyclic adenosine monophosphate；Mice；Immunological function
环磷酸腺苷（cAMP）是由厄尔博士发现，细胞内信号转导过程中重要的第 2 信使，广泛存在于免疫系统中，在临床上主要用于治疗心绞痛、心肌梗死、心肌炎以及辅助治疗白血病、肝炎、支气管炎等疾病。细胞内cAMP 水平受腺苷酸环化酶（AC）和磷酸二酯酶（PDE）的共同调节，AC 促进 cAMP 的合成，而 PDE 可使 cAMP发生水解[1]。当细胞受外界刺激（如激素或神经递质分子等）时，胞外信号分子与细胞膜上受体结合形成复合体，激活 G 蛋白，进而刺激细胞内膜上的AC，催化三磷酸腺
作者简介：王永群，男，主要从事食品营养学工作。通讯作者：马颀，讲师，E-mail：maqi340@163.com
苷（ATP）脱去 1 个焦磷酸，再经过环化反应生成 cAMP。细胞之内 cAMP 升高时会刺激其他蛋白酶发挥作用，抑制细胞生长、分化和增殖[2]，因此被称为细胞内“ 第 2 信使”。cAMP 对机体免疫反应具有选择性抑制作用，对与免疫反应有关的细胞有调节作用。 目前，国内外学者对cAMP 的功能及应用研究表现出极大的兴趣， 但通过查阅文献发现，国内对 cAMP 免疫方向的研究还较少。本实验中，我们通过观察 cAMP 对 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖功能、迟发型变态反应、抗体生成细胞、半数溶血值（HC50）、小鼠碳廓清功能、NK 细胞活力的影响，研究cAMP 对机体固有免疫、体液免疫及细胞免疫功能的影响，为进一步开发 cAMP 的食用及药用价值提供参考。
1 材料与方法
1.1 受试物 枣 cAMP 提取原液购于中恩（天津）医药科技有限公司，枣 cAMP 提取液原液的 cAMP 含量是192 μg/ml。
1.2 实验动物 18～22 g 雌性 SPF 级昆明种小鼠 160只，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供， 合格证号：SCXK（军）2009-00040283302。
1.3 实验动物饲养环境 饲料由天津市华荣实验动物科技有限公司提供，饲料生产许可证号： SCXK （津） 2012-0001 。SPF 级实验动物室，合格证号：SYXK（津） 2008－0004 。温度：20～25 ℃；湿度：40%～70% RH。
1.4 剂量选择 试验设低、中、高 3 个剂量组，高剂量受试样品为枣 cAMP 提取液原液，低、中剂量受试样品为枣 cAMP 提取液原液 1/9 和 1/3 浓度的蒸馏水稀释液，低、中、高剂量组 cAMP 浓度分别是 0.42 mg/kg、 1.28 mg/kg 和 3.84 mg/kg 。高剂量组是用原样测试， 按20 ml/kg·BW 灌胃，对照组给予等量蒸馏水，每日 1 次，连续给药 30 d，末次给药 24 h 后测定各项指标。将实验动物分成 4 个大组，每组 40 只，然后每组 40 只动物又分成 4 个小组，每组 10 只。其中 1 组进行 HC50 测定、抗体生成细胞测、迟发型变态反应（足跖增厚法）；2 组进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验、脏/体比值测定；3 组进行碳廓清试验； 4 组进行小鼠淋巴细胞转化试验、NK 细胞活性测定试验。
1.5 仪器与试剂 洁净工作台、无菌解剖器材、RP- MI1640 细胞培养液、刀豆蛋白、异丙醇、MTT、游标卡尺、绵阳红细胞（SRBC）、微量注射器、都氏试剂、印度墨汁、乳酸脱氢酶（LDH）基液、计时器、血色素吸管、 TU-1810 紫外分光光度仪、离心机（离心半径为 180 mm）、生理盐水、Na2CO3、24 孔培养板、二氧化碳培养箱、酶标仪等。
1.6 实验方法
1.6.1 迟发型变态反应（足跖增厚法） 给予受试物第30 天腹腔注射 2% SRBC，再连续给予受试物至第 35天，测量左后足跖部厚度，同时在测量部位注射 20% SRBC 20 μl，24 h 后再次测量。
1.6.2 刀豆素 A（ConA）诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验（MTT 法） 给予受试物 33 d，无菌取脾，制成单细胞悬液，Hank ’s 液洗 3 遍，调整细胞浓度为 3×106 个/ml。将细胞悬液分两孔加入 24 孔培养板中，每孔 1 ml，1 孔加 75 μlConA 液（100 μg/ml），另 1 孔为对照，置 5% CO2，37 ℃孵箱中培养 72 h 。培养结束前 4 h，每孔吸去
上清液 0.7 ml，加入 0.7 ml 不含小牛血清的 RPMI 1640培养液，同时加入 MTT（5 mg/ml）50 μl/孔，继续培养4 h 。培养结束后，每孔加入 1 ml 酸性异丙醇，吹打均匀，使紫色结晶完全溶解，以 570 nm 波长测定吸光度值。
1.6.3 HC50 的测定 给予受试物第 30 天腹腔注射 2% SRBC，再连续给予受试物至第 35 天，内眦取血，离心收集血清，试管内加入 300 倍稀释的血清 1 ml、10% SRBC 0.5 ml、补体 1 ml，37 ℃水浴 20 min，冰浴终止反应，离心，取上清 1 ml，加都氏试剂 3 ml，10 min 后于540 nm 处比色。
1.6.4 抗体生成细胞检测 给予受试物后第 30 天腹腔注射 2% SRBC，再连续给予受试物至第 35 天，脱臼处死，取脾，制成细胞悬液， 200 目筛网过滤，用 Han- ks 液洗 3 次，每次 1 000 r/min 离心 10 min，将细胞悬浮于 5 ml RPMI 1 640 培养液中，并调整细胞浓度为5×106 个/ml。将表层培养基加热溶解，45 ℃水浴保温，与等量 2 倍浓度 Hanks 液混合，分装于小试管中，每管0.5 ml，加入 50 μl 10% SRBC，20 μl 脾细胞悬液，混匀，倒片，二氧化碳培养箱中培养 1 h，加入 SA。
1.6.5 小鼠碳廓清试验 给予受试物 31 d 后，尾静脉注射 3.5 倍稀释的印度墨汁（每 10 g 体重 0.1 ml），分别于第 2、10 分钟内眦取血 20 μl，加入到 2.98 ml 0.1%碳酸钠溶液中，于 600 nm 处比色。另取肝、脾称重，计算吞噬指数。
1.6.6 NK 细胞活力测定［（乳酸脱氢酶（LDH） 测定法）］ 试验前 24 h 将 YAC-1 细胞（靶细胞）进行传代培养， 用 RPMI 1 640 完全培养液调整细胞浓度为4×105 个/ml。无菌取脾，制成单细胞悬液，Hank ’s 液洗3遍，调整细胞浓度为 2×107 个/ml 。取靶细胞和效应细胞各 100 μl（效靶比 50 ∶1），加入 U 型 96 孔培养板，靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各 100 μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和 1% NP40 各 100 μl，均设 3 个复孔，于 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养 4 h，每孔吸取上清液 100 μl 置平底 96 孔培养板中，同时加入 LDH 基液
100 μl，反应 3 min，每孔加入 1 mol/L 的 HCl 30 μl，在酶标仪 492 nm 处测定吸光度值。
1.7 统计学分析 数据以 x ±s 表示，采用 SPSS 17.0软件对数据进行单因素方差分析， 若差异有统计学意义，进行两两比较的 Dunnett-t 检验；对非正态或方差不齐的数据进行数据转换， 转换后仍不齐则采用非参数统计。检验水准 α=0.05，以 P＜0.05 为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 枣 cAMP 提取原液对小鼠细胞免疫功能的影响
2.1.1 枣 cAMP 提取原液对小鼠迟发型变态反应的影响（足跖增厚法） 用不同浓度的 cAMP（0.42、1.28 和3.84 mg/kg）处理小鼠 30 d 后，结果显示，实验组攻击前后足跖厚度差值与对照组相比，实验组攻击前后足跖厚度差值均高于对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。
表1 枣环磷酸腺苷对小鼠迟发型变态反应（足跖增厚法）的
影响（x±s）
|
组别 |
剂量 （ml/kg·BW） |
动物数（只） |
攻击前后足跖厚度差值 （mm） |
|
低剂量组 |
5 |
10 |
0.49±0.10 |
|
中剂量组 |
10 |
10 |
0.51±0.13 |
|
高剂量组 |
20 |
10 |
0.59±0.21 |
|
对照组 |
0 |
10 |
0.48±0.12 |
|
F 值 |
1.081 |
||
|
P 值 |
0.369 |
2.1.2 枣 cAMP 提取原液对 ConA 诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验（MTT 法） 的影响 用不同浓度的 cAMP （0.42、1.28 和 3.84 mg/kg）处理小鼠 30 d 后，结果显示实验组淋转功能（光密度差值）与对照组相比，实验组吸光度差值高于对照组， 但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 2。
表2 枣环磷酸腺苷对 ConA 诱导小鼠脾淋巴细胞转化
试验（MTT法）的影响（x±s）
|
组别 |
剂量（ml/kg·BW） |
动物数（只） |
吸光度差值 |
|
低剂量组 |
5 |
10 |
0.068±0.062 |
|
中剂量组 |
10 |
10 |
0.069±0.072 |
|
高剂量组 |
20 |
10 |
0.099±0.026 |
|
对照组 |
0 |
10 |
0.053±0.032 |
|
F 值 |
1.333 |
||
|
P 值 |
0.279 |
2.2 枣 cAMP 提取原液对小鼠体液免疫的影响
2.2.1 枣 cAMP 提取原液对小鼠 HC50 的影响 用不同浓度的 cAMP（0.42、1.28 和 3.84 mg/kg）处理小鼠 30 d后，中、高剂量组的小鼠 HC50 高于对照组，且差异有统计学意义（P＜0.05）；低剂量组与对照组相比， 差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 3。
2.2.2 枣 cAMP 提取原液对小鼠抗体生成细胞试验的影响 用不同浓度的 cAMP （0.42、1.28 和 3.84 mg/kg）处理小鼠 30 d 后，实验组小鼠的抗体生成细胞数与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 4。
表3 枣环磷酸腺苷对小鼠半数溶血值（HC50）的影响（x±s）
|
组别 |
剂量（ml/kg·BW） |
动物数（只） |
HC50 |
|
低剂量组 |
5 |
10 |
0.66±0.09 |
|
中剂量组 |
10 |
10 |
0.70±0.03a |
|
高剂量组 |
20 |
10 |
0.73±0.03a |
|
对照组 |
0 |
10 |
0.63±0.07 |
|
F 值 |
4.320 |
||
|
P 值 |
0.011 |
注：a 与对照组比较，P＜0.05。
表4 枣环磷酸腺苷对小鼠抗体生成细胞的影响（x±s）
|
组别 |
剂量（ml/kg） |
动物数（只） |
溶血空斑数(× 103/全脾） |
|
低剂量组 |
5 |
10 |
25.6±9.1 |
|
中剂量组 |
10 |
10 |
26.6±9.7 |
|
高剂量组 |
20 |
10 |
28.4± 11.0 |
|
对照组 |
0 |
10 |
23.7±7.0 |
|
F 值 |
0.455 |
||
|
P 值 |
0.715 |
2.3 枣 cAMP 提取原液对小鼠碳廓清试验的影响 用不同浓度的 cAMP（0.42、1.28 和 3.84 mg/kg）处理小鼠30 d 后，中、高剂量组小鼠的吞噬指数高于对照组， 且差异有统计学意义（P＜0.05）；低剂量组与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 5。
表5 枣环磷酸腺苷对小鼠碳廓清试验的影响（x±s）
|
组别 |
剂量（ml/kg·BW） |
动物数（只） |
吞噬指数 a |
|
低剂量组 |
5 |
10 |
5.47± 1.20 |
|
中剂量组 |
10 |
10 |
6.34± 1.11a |
|
高剂量组 |
20 |
10 |
6.22± 1.42a |
|
对照组 |
0 |
10 |
4.81± 1.07 |
|
F 值 |
3.473 |
||
|
P 值 |
0.026 |
注：a 与对照组比较，P＜0.05。
2.4 枣 cAMP 提取原液 NK 细胞活力的影响（LDH 测定法） 用不同浓度的 cAMP（0.42、1.28 和 3.84 mg/kg）处理小鼠 30 d 后，实验组小鼠的 NK 细胞活性与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 6。
表6 枣环磷酸腺苷对小鼠 NK 细胞活力的影响（x±s）
|
组别 |
剂量（ml/kg·BW） |
动物数（只） |
NK 细胞活力（%） |
|
低剂量组 |
5 |
10 |
25.6±4.3 |
|
中剂量组 |
10 |
10 |
25.2±5.7 |
|
高剂量组 |
20 |
10 |
26.5±6.5 |
|
对照组 |
0 |
10 |
22.3±5.8 |
|
F 值 |
1.053 |
||
|
P 值 |
0.381 |
3 讨 论
目前，国内使用的 cAMP 原料大多依赖于进口，而国外的 cAMP 产品主要是从动物的内脏提取，其成本
高且产量较少，而临床对其的需求量较大，导致 cAMP的价格居高不下，国内外研究者正致力于寻找获取这种天然药物的手段，发现枣果中 cAMP 含量丰富，且我国枣树资源相当丰富[3]。
cAMP 作为细胞内信号转导过程中重要的第 2 信使，广泛存在于免疫系统中， 细胞之内 cAMP 升高时会刺激其他蛋白酶发挥作用，抑制细胞生长、分化和增殖，cAMP 还可激活 cAMP 依赖性蛋白激酶（PKA）使靶细胞蛋白磷酸化， 最终被磷酸二酯酶（PDE）水解成5 ’-AMP 而失活。cAMP 通过提高 T 细胞反应中基因转导水平以调节免疫反应的功能，但其细胞内浓度又受腺苷酸环化酶（AC）、磷酸二酯酶（PDE）的调节。当机体内 cAMP 水平升高时，可激活 PKA，使转录因子磷酸化， 介导 cAMP 引起的基因表达。基因转录区中的cAMP 反应元件（CRE）受 cAMP 水平的调节，与 cAMP应答元件结合蛋白（CREB）相互作用而诱导此基因的转录，这些研究可进一步说明 cAMP 对机体免疫有提高作用[4]。BENBERNOU等研究表明 cAMP 显著抑制 γ 干扰素（IFN-γ) 的表达，提高 IL-10 的表达，而对 IL-4 及IL-13 表达无显著影响，由此表明 cAMP 对细胞免疫因子有调节作用[4] 。BOPP 等[5] 曾指出调节性 T 细胞中含有高水平的cAMP，而 cAMP 可抑制T 细胞增殖及 IL-2合成。综上可知 cAMP 对机体免疫功能有调节作用。
本研究我们以 cAMP 对小鼠迟发型变态反应、抗体生成细胞、HC50 等的影响为切入点阐述了 cAMP 对机体的免疫调节作用。结果表明，经口给予不同剂量的枣 cAMP 提取原液 30 d 后，各组动物生长活动正常；中（1.28 mg/kg）、高（3.84 mg/kg）剂量组的吞噬指数、HC50高于对照组（P＜0.05）；其他各项试验未见免疫抑制现象。该结果表明，cAMP 对小鼠非特异性免疫功能增强
作用有显著性影响，对体液免疫功能、细胞免疫功有增强作用，因此说明cAMP 具有免疫调节活性。
有药理研究还表明，外源性 cAMP 具有改善心血管功能、改善肝功能、促进神经再生、抑制皮肤外层细胞分裂和转化异常细胞、促进呼吸链氧化酶的活力、改善心肌缺氧、抑制肿瘤细胞生长等功能[6-7]。
由此发现，cAMP 不仅可调节机体免疫功能，还可对机体心血管、神经等起保护作用，表明 cAMP 在医药和保健品等方面具有一定的开发潜力和应用前景。
作者声明 本文无实际或潜在的利益冲突
参考文献
［1］YAMAMOTO S，YAMAMOTO N ，KITAMURA T ，et al. Proliferation of parenchymal neural progenitors in response to injury in the adult rat spinal cord［J］. Exp Neurol，2001，172（1）：115-127.
［2］BODOR J，FEIGENBAUM L，BODOROVA J，et al. Suppression of T-cell responsiveness by inducible cAMP early repressor （ICER）［J］. J Leukoc Biol，2001，69（6）：1053-1059.
［3］蒋劢博. 红枣中环磷酸腺苷提取与纯化工艺研究［D］. 乌鲁木齐：新疆农业大学，2013：10-12.
［4］BENBERNOU N ，ESNAULT S ，SHIN HC ，et al. Differential regula- tion of IFN-gamma，IL-10 and inducible nitric oxide synthase in hu- man T cells by cyclic AMP-dependent signal transduction pathway［J］. Immunology，1997，91（3）：361-368.
［5］BOPP T ，BECKER C ，KLEIN M ，et al. Cyclic adenosine monophos- phate is a key component of regulatory T cell-mediated suppression［J］. J Exp Med，2007，204（6）：1303-1310.
［6］党立，王希敏，韩利文，等. 环磷酸腺苷的临床应用进展［J］. 山东科学， 2007（3）：61-64.
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收稿日期：2016-07-30 修回日期：2016-09-30 责任编辑：张军
红枣提取液的环磷酸腺苷每百毫升≥25毫克
