cAMP /PKA 信号通路在肾上腺肿瘤中的作用
张 科，刘昌荣
［摘要］
目的 探讨 cAMP / PKA 信号通路在肾上腺肿瘤中的作用。方法 将人肾上腺肿瘤 H295R 细胞随机分为对照组、实验组 A 及实验组 B，对照组不进行处理，实验组 A 加入 cAMP 衍生物 db-cAMP，实验组 B 加入 db-cAMP及 cAMP / PKA 信号通路抑制剂 H-89，分别检测细胞 PKA 活性 ; 应用 Western Blot 方法检测 cAMP / PKA 信号通路下游CREB 蛋白的磷酸化水平 ; CCK8 实验检测细胞 72 h 的增殖水平 ; 糖皮质激素分泌实验检测 3 组 H295R 的激素分泌能力。结果 实验组 A 的 PKA 活性水平、CREB 蛋白的磷酸化水平、细胞增殖水平、糖皮质激素分泌水平均较对照组和实验组 B 显著升高 (P＜0. 05) ; 而实验组 B 与对照组比较差异无统计学意义 (P ＜0. 05) 。结论 cAMP / PKA 信号通路的异常活化能够促进肾上腺肿瘤的形成与功能的发挥。
［关键词］ 肾上腺肿瘤 ; 环磷酸腺苷 ; 蛋白激酶 A
［中国图书资料分类号］ R736．6 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 2095-140X(2016) 08-0015-04
［DOI］ 10．3969 /j．issn．2095-140X．2016．08．004
Effect of cAMP /PKA Signaling Pathways on Adrenal TumorsZHANG Ke，LIU Chang-rong (Department of Urinary Surgery，the First Hospital of Yichang，Yichang，Hubei 443000， China)
［Abstract］ Objective To investigate effect of cyclic adenosine monophosphate / protein kinase a (cAMP / PKA) signaling pathways on adrenal tumors．Methods Human H295R cells of adrenal tumor cells were randomly divided into control group，group A and B．Control group did not undergo any treatment ; group A was incubated with cAMP deriva- tives db-cAMP ; group B was incubated with db-cAMP and inhibitor of cAMP / PKA signaling pathway H-89．In three groups，PKA activities were detected，and phosphorylation levels of CREB protein were also detected by Western Blot method ; 72 h cell proliferation levels were detected by CCK8 assay，and capacities of hormone secretion were detected by glucocorticoid secretion experiment．Results Levels of PKA activity，CREB protein phosphorylation，cell proliferation and glucocorticoid secretion were significantly higher in group A than those in control group and group B (P ＜0．05) ; there were no significant differences in the levels between group B and control group (P＞0．05) ．Conclusion The ab normal activation of cAMP / PKA signaling pathways can promote formation and functional effect of adrenal tumors．［Key words］ Adrenal gland neoplasms ; Cyclic adenosine monophosphate ; Protein kinase a
环磷酸腺苷 ( Cyclic Adenosine monophosphate， cAMP) 信号通路在内
分泌系统中与细胞的增殖、分化与凋亡密切相关 。蛋白激酶 A ( PKA) 是 cAMP的一个主要效应分子，可以磷酸化多种细胞质与细胞核 内 的蛋 白，特别是 CREB / ATF 家族 的转录 因子 。cAMP 信号通路的活化可以增强多种内分泌细胞的复制和功能，包括肾上腺皮质细胞 。 因此cAMP 信号通路的改变可以引起多种内分泌疾病。正常情况下，内分泌细胞的功能是通过垂体分泌的促肾上腺皮质激素 (ACTH) 与细胞表面的一种 G 蛋白偶联受体即黑皮质素受体( MC2R) 结合引起细胞内 cAMP 的聚集与 PKA 的活化，最终使肾上腺皮质细胞产生糖皮质激素。 肾上腺肿瘤在人群中的发病率是 1% ，其中备受关注的恶性肾上腺皮质癌占恶性肿瘤的比例是 0．05% ～2% 。PKA 信号通路虽然已研究多年，但近期才发现与内分泌系统肿瘤形成相关。 因此，本实验对 cAMP / PKA 信号通路在肾上腺肿瘤中的作用进行研究，为治疗肾上腺肿瘤提供一些理论依据。
1 材料和方法
1. 1 材料 H295R 细胞购自中科院，FBS、0．25%胰酶购 自 Gibco，DMEM / F12 细胞培养基购自 Hy- clone，cAMP / PKA 信号激动剂 db-cAMP 购自 Sigma公司，抑制剂 H-89 购自碧云天，PepTagAssay 分析试剂盒购自 Promega，抗 CREB 与抗-磷酸化 CREB 抗体均购自 Abcam，HRP 标记二抗购自 Jackson Immu- noresearch，CCK8 试剂盒购自同仁公司。使用仪器有 : Thermo 公司 HERAcell 2401 细胞培养箱、Beck- man 的离心机 ; BioTek 的 PowerWaveTM 微孔板分光光度计 以及购 自 bio-rad 的 Western blot 相关仪器耗材。
1. 2 方法
1. 2. 1 细胞培养 : 将人肾上腺肿瘤细胞 H295R 置于含 10% FBS 的 DMEM / F12 培养基中，于 37℃ 5% CO2 的培养箱中孵育培养，至细胞密度 80% ～90%时，0．25% 胰酶消化传代扩增，用于后续实验。
1. 2. 2 PKA 活性检测 : 将培养的 H295R 细胞分 3组，分别铺至细胞培养皿内，37℃ 5% CO2的培养箱中培养细胞密度 70% ～80%时，分别做如下处理 :对照组不处理，实验组 A 加入500 μmol / L cAMP / PKA 信 号 激 动 剂 db-cAMP ，实 验 组 B加入500 μmol / L db-cAMP与10μmol / L的 H-89，作用2 h 后用 PepTagAssay 分析试剂盒 ( Promega ) 检测PKA 活性，并用 Western Blot 检测该条件下细胞内c-AMP / PKA 下游分子 CREB 和磷酸化 CREB 水平。
1. 2. 3 Western Blot 实验 : 将 1．2．2 中 3 组细胞以RIPA 裂解液收集，于冰上裂解 5 min，煮沸 8 min 后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS- PAGE) ，电泳条件 80 V 20 min，120 V 60 min 。之后将凝胶取出，通过转膜仪将蛋白转移至 PVDF 膜上，转膜条件 100 V 90 min，待转膜结束后将 PVDF 膜取出。5% PBS-脱脂奶粉室温封闭 1 h，一抗经封闭液1 : 1000 稀释后 4℃ 摇床孵育过夜，PBST 洗膜 4 次，每次 5 min 。HRP 标记二抗经封闭液 1 : 5000 稀释后室温孵育 1 h，PBST 洗膜 4 次，每次 5 min，ECL检测。
1. 2. 4 CCK8 细胞增殖实验 : 将 H295R 细胞铺至96 孔细胞培养板 内，每孔 1000 个细胞，37℃ 5% CO2 培养箱中培养至细胞贴壁后约 6 h，将细胞分为3 组 : 对照组不处理，实验组 A 每孔加入 500 μmol / L db-cAMP，实验组 B 每孔加入 500 μmol / L db-cAMP以及 10 μmol / L 的 H-89，3 组均于细胞培养箱内继续培养 72 h 后，每孔加入 10 μL CCK8 溶液，37℃ 5% CO2 培养箱中孵育 4 h，在 450 nm 测定吸光度值，每组设 3 个复孔。
1. 2. 5 糖皮质激素分泌实验 : 用含有 0．05 mmol / L EGTA 的 PBS 清洗两次贴壁培养的 H295R 细胞，然后再用 DMEM / F12 清洗 1 次。清洗后的细胞分为 3组 : 对照组加入 1 ml 普通含 10% FBS DMEM / F12培养 基，实 验 组 A 同 时 加 入 含 500 μmol / L db- cAMP，实验组 B 则同时加入 500 μmol / L db-cAMP以及 10 μmol / L 的 H-89，分别置于培养箱中孵育培养 2 h 后，取0．5 ml 上清用于糖皮质激素分泌检测，将上清与 CH2 Cl2 混合后转移至硫酸溶液 ( 硫酸 ∶ 乙醇 = 7 ∶ 3) 中，分别检测 520 nm 和 390 nm 处吸光度值［7］，同时以 0．25% 胰酶消化细胞后使用血球计数板计数。
1. 3 统计学方法 应用 SPSS V19．0 软件对数据进行分析，计量资料以均数土标准差 (x ± s) 表示，两两比较使用 t 检验，α = 0．05 为检验水准。
2 结果
2. 1 3 组 PKA 活性水平比较 对照组 PKA 活性为( 1．00 ± 0．12) ，实验组 A 为对照组的 ( 1．97 ± 0．07)倍，实验组 B 为对照组 (0．88 ± 0．13) 倍。实验组 A与对照组和实验组 B 差异有统计学意义 ( P < 0. 05) ，而实验组 B 与对照组差异无统计学意义(P＞0. 05) 。见图 1 。
对照组不处理，实验组 A 为 db-cAMP 处理，实验组 B 为 db- cAMP + H-89 处理; 与对照组及实验组 B 比较，aP＜0. 05
2. 2 3 组 CREB 蛋白的磷酸化水平比较 与对照组、实验组 B 相比，实验组 A 明显升高 (P ＜0. 05) ，实验组 B 与对照组相比差异无统计学意义 ( P ＞ 0. 05) 。见图 2 。
对照组不处理，实验组 A 为 db-cAMP 处理，实验组 B 为 db- cAMP + H-89 处理
2. 3 3 组 cAMP / PKA 信号通路活化与细胞增殖水平比较 对照组增殖水平为 ( 1．00 ± 0．21) ，实验组A 中 H295R 细胞数为对照组 ( 1．43 ± 0．33) 倍，实验组 B 为对照组 (0．83 ± 0．19) 倍。实验组 A 较对照组与实验组 B 显著升高 (P ＜0. 05) ，实验组 B 与对照组 比较差异无统计学意义 ( P ＞ 0. 05 ) 。 因 此cAMP / PKA 信号通路的活化可促进肾上腺肿瘤细胞H295R 增殖，并且该作用可被 H-89 抑制。见图 3 。
对照组不处理，实验组 A 为 db-cAMP 处理，实验组 B 为 db- cAMP + H-89 处理; 与对照组及实验组 B 比较，aP＜0. 05
2. 4 3 组 cAMP / PKA 信号通路活化与糖皮质激素分泌水平 比较 糖皮质激素分泌水平对照组为(2．71 ± 0．26 ) pmol /1000 个 细 胞，实 验 组 A 为(4．43 ± 0．19 ) pmol /1000 个 细 胞，实 验 组 B 为(3．01 ± 0．13 ) pmol /1000 个细胞。 实验组 A 高于对照组及实验 B 组 (P＜0. 05) ，实验组 B 与对照组差异无统计学意义 (P＞0. 05) 。见图 4 。
对照组不处理，实验组 A 为 db-cAMP 处理，实验组 B 为 db- cAMP + H-89 处理; 与对照组及实验组 B 比较，aP＜0. 05
3 讨论
cAMP / PKA 信号通路在真核生物 内 高 度保守，PKA 作为 cAMP 下游的一种丝氨酸/ 苏氨酸激酶，全酶呈异源四聚体结构，含两个调节亚基和两个催化亚基，PKA 在非活化状态下调节亚基占用催化亚基的活化位点，抑制 PKA 的催化活性，当调节亚基与 cAMP 结合后 PKA 构象发生改变，催化亚基被释放，继而磷酸化下游的 CREB 蛋白，激活相关DNA 转录，产生多种生物学效应 。CREB 的磷酸化水平一定程度上可以反映 cAMP / PKA 信号通路的活化程度。本文通过 cAMP 的一种衍生物 db- cAMP 对实验组 A 中 H295R 细胞进行处理，经检测，细胞 PKA 活性较对照组明显增加，下游 CREB蛋白的磷酸化水平显著升高，cAMP / PKA 信号通路活化，从而促进 H295R 细胞的增殖与糖皮质激素的释放，并且该过程均可被 cAMP / PKA 信号通路抑制剂 H-89 逆转。 因此，通过 cAMP 衍生物活化细胞内cAMP / PKA 信号通路，能够促进肾上腺肿瘤细胞的增殖，并影响其内分泌功能。
关于 cAMP / PKA 信号通路的研究已有多年，首先发现 PKA 与人类疾病相关的是在大量 Carney 综合征 ( CNC) 患者中检测到编码 PKA 调节亚基 Iα 的基因 PRKAR1A 发生沉默，同时，PRKAR1A 的表达水平被证实与甲状腺肿瘤的发生及恶性程度相关。PKA调节亚基 α 基因 PRKACA L205R 位点突变通过促进下游靶蛋白的表达与磷酸化水平，从而影响肾上腺皮质肿瘤的糖皮质激素分泌和库欣氏综合征的发生。另外，有研究报道，在结节性肾上腺皮质增生 ( MAH) 患者可检测到 cAMP 结合性磷酸二酯酶缺陷，在 ACTH 依赖的肾上腺结节样增生患者，皮质醇的分泌与细胞表面 G 蛋白偶联受体表 达 异 常 相 关，而 在 17q22 ～ 24 片 段 缺 失 的ACTH 依赖的肾上腺结节样增生患者中可检测到cAMP / PKA 信号通路的改变。但近期有报道，异常的 PKA 信号通路与内分泌系统肿瘤的形成相关 。cAMP / PKA 信号通路的抑制可能导致肿瘤的发展与激素分泌异常，如在甲状腺瘤和生长激素分泌的垂体腺瘤。肾上腺肿瘤根据是否具有分泌功能分为功能性与非功能性肿瘤，以恶性的肾上腺皮质癌为例，60%为功能性，其中以分泌糖皮质激素中的皮质醇为主，部分患者可表现出高血压，骨质疏松等典型的库欣综合征症状。 因此，对于肾上腺肿瘤的研究，除细胞增殖水平外，糖皮质激素分泌水平的检测也至关重要。本文中所使用的 H295R 细胞来源于人肾上腺皮质癌，具有分泌多种激素功能，可分泌包括皮质醇、皮质酮、醛固酮和雄激素等在内的多种内分泌激素，亦可表达多种类固醇生成相关信号通路。本文以肾上腺肿瘤细胞 H295R 为工具，研究 cAMP / PKA 信号通路的异常活化与细胞增殖与激素分泌能力的关系，通过 db-cAMP 激活 cAMP / PKA 信号通路能够促进细胞的增殖与糖皮质激素的释放。除细胞自身因素，如 PRKAR1A 异常、cAMP / PKA 信号通路相关酶缺陷、G 蛋白受体表达异常等可能促进肾上腺肿瘤的形成外，细胞外因素异常活化 cAM / PKA 在肿瘤的形成过程中也发挥重要作用。总之，cAMP / PKA 信号通路常作为多种药物的作用靶点，如 RU486、Let-7以及 H-89 等，在评估人体胎盘类固醇生成的试验中，H-89 可有效抑制PKA 活 性，从而减少线粒体中孕酮的合成。 cAMP / PKA 信号通路的发现对肿瘤学，特别是内分泌肿瘤的研究与治疗具有重要意义。
注：
团体标准检测：红枣提取液中的环磷酸腺苷每百毫升≥25毫克
