红枣中环磷酸腺苷的分离纯化及其口服液的开发
研究生姓名:段禹轩
专业名称:食品工程
指导教师姓名:李建颖教授
李有起 高级工程师
张斌 高级工程师
论文提交日期:2013年5月
学位授予单位:天津商业大学
摘 要
天然产物中的功能性成分既可以作为保健食品的关键原料又可以入药治疗各种疾病，所以对天然产物中功能性成分的研究、分离、纯化越来越重要。红枣中含有含量很高的环磷酸腺苷(cAMP)，其含量在 180 多种天然植物中是最高的。cAMP 是细胞内参与调节生物学功能和物质代谢的重要物质，是生命信息传递的“第二信使 ”，它有着抗癌、抗氧化、帮助人体内物质代谢、提高人体免疫等功效。所以对红枣中cAMP的分离纯化的研究，以及利用分离纯化出的 cAMP 做成附加值较高的保健食品，都有着较高的经济价值和社会效益。
本文选择红枣为分离纯化 cAMP 的实验原料。由于红枣提取液中含有胶原蛋白、纤维素等物质，而这些物质的存在影响了 cAMP 的抽提、分离和纯化， 故可以利用复合果浆酶对红枣提取液进行水解以消除这方面的影响。本实验主要通过水浴加热浸提法以及离子交换法对红枣中的 cAMP 进行分离，经过浓缩和真空冷冻干燥得到 cAMP的冻干粉粗品。然后采用硅胶柱层析方法对其进行纯化， 经过浓缩和真空冷冻干燥后即可得到 cAMP 的冻干粉纯品。采用高效液相色谱法作为 cAMP 的主要检测方法。
本实验主要包括以下三部分内容：
（1）红枣中 cAMP 浸提工艺的优化将红枣原料经过清洗破碎后，加入适量的纯水混匀，在不同实验条件（浸提时间，浸提温度，料液比）下进行热水浸提。提取液经 0.45μm 膜过滤后，用高效液相色谱法检测 cAMP 的含量。通过对热提取工艺的单因素和正交实验的结果分析可以得知， cAMP 分离的最佳工艺条件为：料液比 1 ∶4，浸提温度 80℃,浸提时间 5h。然后用甲酸改型后的阴离子交换树脂进行分离，经旋转蒸发器进行浓缩、真空冷冻干燥处理后即可得到 cAMP 粗品。
（2）红枣中 cAMP 纯化工艺的优化
准确称取经提取工艺分离的 cAMP 粗品，按不同的上样液影响条件（浓度、流速、 pH 值）进行纯化处理。收集流出液经 0.45μm滤膜后， 用高效液相色谱法检测 cAMP的含量。通过对纯化工艺的单因素和正交实验的结果分析可以得知， cAMP 纯化的最佳工艺条件为：上样流速 2 mL/min 、pH 值 4.5、浓度 0.5mg/mL。然后用乙酸乙酯∶苯∶甲醇（ 1 ∶ 1 ∶3）作为洗脱剂，对已经吸附的硅胶柱进行洗脱，经浓缩、真空冷冻干燥后即可得到 cAMP 纯品。经高效液相色谱法检测后证明， 分离纯化后的 cAMP纯品含量可达到 95%左右。
（3）cAMP 口服液的研制
以从红枣中分离纯化出的 cAMP 为主要材料研制 cAMP 口服液，通过稳定性实验测定 cAMP 口服液的稳定期。由实验结果可知，此 cAMP 口服液应在 35℃以下避光保存，贮藏性状稳定。
关键词：红枣；cAMP；提取；纯化；口服液
一章 前 言
1.1 红枣简介
1.1.1 概述
红枣是原产中国的传统名优特产树种，据考古学家考证，红枣在中国已经有八千多年的种植历史，又名大枣、干枣、枣子， 可谓是历史悠久的古老经济植物。自古以来红枣就被人们同桃、李、梅、杏、枣合并列称为“五果”[ 1]。
中国枣资源极为丰富，至今已有 3000 多年的栽培历史，在世界上有着独一无二的生产栽培优势。据统计， 中国的枣树种植面积和产量占全世界的 99%，近年来正在成为我国果树中新的发展热点[2]。所以对红枣的开发和加工具有巨大的发展空间和经济效益。尤其是在 2001 年中国加入 WTO 之后，给中国的农副产品生产加工带来了巨大的商机，所以红枣的生产以及深加工更有着巨大的经济潜力和价值[3]。
红枣是鼠李科植物枣树的成熟果实，营养极为丰富，富含有机酸、生物碱类、三萜甙类、糖类、黄酮类、维生素类以及豆甾醇（Stigmasterol）、谷甾醇（Sitosterol）、链甾醇（Desmasterol）[4]。红枣中所含的糖类主要是葡萄糖，亦含蔗糖、果糖、由葡萄糖和果糖组成的低聚糖、半乳醛聚糖以及阿拉伯聚糖等[5]。且含有丰富的脂肪、蛋白质、胡萝卜素、B 族维生素、维生素 C、维生素 P 以及磷、钙、铁和环磷酸腺苷（Cyclic Adenosine monophosphate，cAMP）等营养成分[6]。同时还发现红枣中存在着一种称大枣果胶（Zizyphus- pectin）A 的酸性多糖。此外，红枣中尚含黏液质、树脂、香豆素类衍生物、鞣质（Tannin）、儿茶酚（Catechol）、挥发油、13 种氨基酸及铁、钙、磷、硒等 36 种微量元素[7]。
红枣作为中药应用已有 2000 多年的历史，早在《神农本草经》中就已有文字记载，历代药籍医书也均有提及。并且通过前人不懈的研究发现， 人们对红枣养生疗病的功效和作用机理的认识也不断得深化。早在明代， 著名医药家李时珍曾在《本草纲目》中记载：“其气味甘平，主治心腹邪气，安中，养脾气，平胃气，通九窍，助十二经久服轻身延年”。所以常食红枣可治疗神经衰弱、劳伤咳嗽、脾胃不和、身体虚弱、消化不良、贫血消瘦，其中红枣养肝防癌功能尤为突出[8]。通过多年的对红枣的药理研究发现，红枣中富含许多生物活性物质，这些活性物质对人体有保健功效，中医认为，红枣味甘、性微温，具有多种食疗功效[9]。
多食红枣有着抗癌的保健功效，因为红枣中富含 cAMP 可以在机体内参与细胞分裂与分化、形态形成、类固醇生成、糖原和脂肪分解等多种生理生化过程， 并可作用于基因转录，从而影响蛋白质的合成[ 10, 11] 。cAMP 对治疗各种肿瘤疗效显著，这是因为它能有效抑制人体中亚硝酸盐类物质的形成，从而阻止癌细胞的形成与增殖，甚至可使癌细胞转化正常细胞[ 12, 13]。另外，红枣中富含的三萜类化合物也同样具有抑制癌
细胞的效果，尤其是山楂酸，它的作用效果甚至超过了常用的抗癌药氟脲嘧啶[ 14]。
多食红枣还有抗氧化的功效，因为红枣中丰富的维生素 C 有很强的抗氧化活性，可有效的促进胶原蛋白的合成以及参与机体组织细胞的氧化还原反应，充足的维生素C 能够促进生长发育、增强体力、减轻疲劳，降血压、 降胆固醇。红枣中的维生素P 含量在果蔬中是最多的，它可以维持毛细血管通透性，改善微循环，还可促进维生素 C 在人体内积蓄。另外， 红枣中富含的维生素 E 也具有抗氧化、抗衰老的作用[ 15]。
另外，红枣中所含的皂类物质，具有调节人体代谢、抗变态反应、抗炎、增强免疫力、降低血糖和胆固醇含量等重要作用[ 16]。红枣中所含的芦丁有保护毛细血管通畅、防止血管壁脆性增加的作用，对高血压、动脉粥样硬化等病有疗效； 所含的黄酮类物质可用于高血压和动脉硬化的预防和治疗[ 17]。红枣多糖是红枣中重要的活性物质， 可以通过补体活性和促进淋巴细胞增殖来提高机体的免疫力[ 18]。
多食用红枣还可以抗过敏，据临床证明，它可以治疗过敏性紫癜。这主要是因为当机体摄入足量的 cAMP 后，免疫细胞中 cAMP 的含量也会随着升高从而抑制机体免疫反应，以达到抗过敏功效[ 19]。此外红枣中一种称为乙基-D-呋喃葡萄糖苷的衍生物对 5-羟色胺和组织胺有对抗作用，因而具有抗过敏的作用。且红枣中含有达玛烷型皂甙，与人参中所含的成分类同，具有增强人体耐力和抗疲劳的作用[20]。
1.1.2 红枣中的 cAMP 的研究现状
cAMP 由 Sutherland 于 1957 年在哺乳动物的组织中发现，由此 Sutherland 在 1971年获得生理和医学诺贝尔奖。1963 年，Prie 在哺乳动物的组织中发现了鸟苷-3',5'-环-磷酸（cyclic guanosine monophosphate, cGMP）[21]。之后，人们相继从微生物和植物中发现了环腺苷酸，并证明二者是生物界普遍存在的两种生物活性物质[22,23]。
据研究证明，在已测动植物中，红枣中cAMP含量最高，是一般动植物的数千至数万倍[24]。通过K.Hanabusa等研究发现，大枣中cAMP的含量在苔藓植物、蕨类植物和种子植物等高等植物中最高，大约是鳄梨含量10倍以上[25]。在70年代末期，日本研究者发现大枣具有使白血球内cAMP含量升高的作用[26] 。Jyong-chynl cyong等率先成功利用离子交换柱从枣中分离出cAMP，之后其又从大枣中成功分离出cGMP，并且对cAMP 、cGMP的分离提取工艺进行了优化实验[27]。
1991年刘孟军等人测定了14种枣以及酸枣中cAMP含量，结果发现山西木枣中cAMP含量为最高[28]。在此之后，有研究者利用超声复合膜技术成功的提取了枣中cAMP [29]。
目前为止，对红枣中 cAMP 的研究基本还都处于实验室研究的阶段，都没有进行大规模的产业化开发生产，所以直到现在为止，还没有从红枣中提纯的 cAMP 工业化产品问世。
1.2 cAMP 结构和性质
在上世纪七十年代有研究者发现，红枣中含有大量的 cAMP，红枣中 cAMP 含量
约为 100~600 nmol/g, 其含量在 180 多种天然植物中最高[30] 。cAMP 可以调节细胞内物质代谢和生物学功能，是传递生命信息的“第二信使 ”。cAMP 由三磷酸腺苷在腺苷环化酶催化下生成，为蛋白激酶致活剂，是核苷酸的衍生物。它是广泛存在机体内的一种具有重要生理活性的物质，能调节机体细胞的多种功能活动[31]。
cAMP 是在某些激素或其它分子信号通过刺激活腺苷酸环化酶催化 ATP 环化而形成的。其信号的继续传递依赖于蛋白激酶 A(protein kinase A,PKA)，在大肠杆菌（E.coli）中 cAMP 也参与转录调控过程。
cAMP 水合物是类白色或者是淡黄色的结晶，其味道是令鼠厌的气味。它的熔点为 219~220℃(分解)，其比旋度为—51.3。(C=0.67)。cAMP 可溶于水、甲醇等， 但是不溶于乙醇或乙醚。cAMP 稳定性良好，对酸、碱、热都非常稳定[32]。
1.3 cAMP 的来源
1.3.1 cAMP 的化学合成方法
1.3.1.1 化学合成方法
外国研究者曾用，4-吗啡啉-N,N-二环己基眯和5 ＇-核苷酸在有毒的吡啶中用DC作脱水剂成功合成了cAMP，但是在此合成过程中需要的溶剂需要稀释很多倍，使得吡啶的需要量大幅度增加，吡啶有毒不仅会造成环境污染，而且在人体内会有富集残留对人体产生不利的影响，所以存在着一定的缺陷[33]。后来我国学者在以上研究基础上利用安全性高的溶剂，经过调节pH值，回流，过滤，结晶，干燥等方法合成了cAMP粗产品[34]。但是合成率不够高， 为了进一步提高得率，在2003年，我国研究者在低温下经过一系列的中间反应，终于合成得到了较高纯度的cAMP[35]。后又有学者以腺苷为原料，三氯氧磷为磷酞化试剂，用磷酸三乙酯作溶剂，低经过一系列中间反应得到纯度高的cAMP 。.
1.3.1.2 微生物发酵法
研究者利用重组基因的手段获得了可以发酵生产cAMP的菌种，配制特定的适合
此菌种微生物发酵的培养基，将菌种接种到培养基上在28℃的条件下药床上培养14小时，合成了一定浓度的cAMP，但是此通过微生物发酵的方法难以合成纯度较高的
cAMP[36]。还有人利用全细胞生物催化生产环磷酸腺苷的方法，其特征在于以多羟基有机试剂保护酶的活性,以环磷酸腺苷前体物质和磷酸根离子为底物，以葡萄糖为能量供体，加入金属离子，利用有透性的微生物菌株，全细胞催化生产cAMP [37]。
经过研究结果总结得出，对天然植物中 cAMP 的提取方法主要有溶剂提取法、物理辅助提取法及超临界流体萃取的方法[38]。
1.3.2.1 溶剂提取法
溶剂提取方法主要有乙醇提取和水浸提两种方法。利用水浸提的方法需要样品能溶于水，而且需要所测样品的性质在水中要保持稳定。据文献报道， 利用热水进行提取的效果要高于用常温或冷水的提取效果[39]。乙醇提取法的关键是要选择好乙醇的浓度。因为被检测的目标成分会随着乙醇浓度的变化，溶解度会有所变化[40]。
1.3.2.2 物理辅助提取法
微波和超声波提取法，都是物理辅助提取的方法。超声波通过它的空化作用和机械振动作用对植物的细胞壁进行破碎，从而有助于目标产物的提取。利用微波提取cAMP 是通过其强大的电磁波能，使细胞液内部的压力及温度迅速升高使细胞壁破碎，利于有效成分从细胞内溶出且被周围的溶剂溶解，从而有利于目标产物的浸出[41]。
1.3.2.3 超临界流体萃取法
超临界流体萃取法主用是利用二氧化碳来转化成超临界流体来对目标产物进行提取的。这种萃取方法在无氧的条件下也可以进行测定； 操作条件易控制并且具有选择性；所用的流体溶剂没有毒副作用；在提取完成后没有溶剂的残留[42]。具有很多的优点。
1.4 cAMP 的生理功能
1.4.1 cAMP 对神经系统的调节作用
通过研究证明，cAMP 可以参与人体中枢神经系统和周围神经系统的各种神经活动的调节。它的作用原理主要是通过改变膜的离子通透性， 以增大 Na+ 、K+外流效应从而达到调节神经活动的目的[43]。
外源性的 cAMP 可使神经细胞产生类似去甲肾上腺素的超极化作用，同时还可以提高相关酶的生物活性活性，影响调节多种参与神经活动的神经介质的合成，从而对神经冲动传导和兴奋传递起到调节作用[44,45]。
1.4.2 cAMP 对基因的调节作用
经过大量的研究和临床实验证明，cAMP 是一种极为重要的基因表达的调控活性物质。
在原核细胞中 cAMP 可以直接活化 RNA 聚合酶促进转录作用；同时 cAMP 也可以与受体蛋白结合，直接活化启动基因，促进转录作用[46]。
在真核细胞中 cAMP 可以激活组蛋白激酶，组蛋白酶可以进一步催化组蛋白、以及非组蛋白的磷酸化，被磷酸化的组蛋白由于构象的改变而失去对 DNA 的结合力，从而与 DNA 分离，解除组蛋白对基因的封闭作用，使转录得以进行。另外非组蛋白进行磷酸化，使其与组蛋白的结合力增强，从而促使组蛋白与 DNA 分离，增强了转录作用[47]。
另外，cAMP 不但可以在基因转录水平上起到调节作用，还可以在翻译水平上进行调节，被 cAMP 激活的蛋白激酶通过使核糖体中的某些蛋白质磷酸化，从而加速翻译过程，从而促进特异蛋白质合成[48]。
cAMP 是某些激素的“第二信使”，它可以通过激活心肌细胞所需要的蛋白激酶，使底物蛋白磷酸化[49]。cAMP 同时对体内某些参与物质氧化过程的酶类有着活化作用，从而可以调节心肌的物质代谢和能量代谢[50,51]。
cAMP 水平下降会引起机体血管壁一系列病理改变，同时使物质代谢和能量代谢降低，从而造成心肌细胞坏死与钙化，引起动脉粥样硬化、心律失常、心肌梗死等各种心脏疾病[52,53]。
根据研究发现，牛皮癣病人的发病部位的上皮中是由于生成 cAMP 的腺苷酸环化酶活性下降，从而导致 cAMP 生成不足而使其含量下降[54]。
另外，在哮喘和特异性皮炎病人的白细胞中 cAMP 水平也比正常人要低，这些临床发现对治疗过敏性疾病有着极为重要的意义[55]。
1.4.5 cAMP 的抗癌作用
根据研究发现，细胞内 cAMP 含量升高可以抑制细胞的生长速度，从而防止细胞的过度增殖，相反，使失去接触抑制的细胞又重新恢复控制性生长。所以凡是能使细胞内 cAMP 含量下降的因素均能促进细胞过度生长。当在体外培养的肿瘤细胞中加入cAMP 或其衍生物，可以使肿瘤细胞生长恢复到接触抑制的控制状态，甚至有几率在形态上转变为正常细胞[56]。又有研究表明， Ⅰ型蛋白激酶活性升高与细胞分裂调节有关，当 cAMP 水平下降时激活Ⅰ型蛋白激酶，进而激活参与细胞分裂的特异酶系而加速细胞分裂和过度增殖[57,58]。
目前研究者普遍认为，cAMP 可以引起癌变细胞膜通透性的改变，正常的细胞可以在血清因子的调节下控制细胞膜使营养物质进入细胞内得到控制从而抑制其生长繁殖，而癌细胞 cAMP 水平下降使细胞膜不再受血清因子的制约，使得营养物质不断进入细胞内使细胞过度增殖；而且癌细胞膜生化改变，导致 cAMP 水平降低，从而促进细胞分裂而产生癌变[59]。
1.6 cAMP 的应用价值
cAMP 是在机体内广泛存在的参与细胞内调节物质代谢和生物学功能具有生理活性的重要物质，是由腺苷环化酶催化三磷酸腺苷而生成，可以调节细胞的多种功能活动，是一种广泛存在于有机体内的具有重要的生理活性物质。
1.6.1 cAMP 在医学上的应用
1.6.1.1 治疗心血管疾病
cAMP 具有营养心肌、正性肌力、舒张血管、抗心律失常等作用。它主要可以增强心肌收缩力和增加心排出量， 并扩张冠状动脉。在医学临床上，其药制品通常用于治疗心肌梗死、心绞痛、心肌炎以及心源性休克等心脏疾病。同时对缓解风湿性心脏病的心悸、气急、胸闷等症状也有一定的作用[64]。
1.6.1.2 治疗神经系统疾病
cAMP 能模拟神经生长因子促进神经生长、存活和分化的作用[65,66]。研究表明通外源性的 cAMP 可使神经细胞产生类似去甲肾上腺素的超极化作用和提高相关酶的生物活性活性，影响调节神经介质的合成，调节神经冲动传导和兴奋传递[67]。在医学临床上，可以用 cAMP 治疗神经系统疾病。
1.6.1.3 治疗肝胆疾病
研究表明：cAMP 可以提高血浆和肝细胞内 cAMP 的含量， 从而提高胆汁流量，增加胆汁的排泄。医学临床上，通常用 cAMP 联合 FDP 治疗慢性淤胆型肝炎。可以促进肝功能恢复的同时可显著促进黄疸的消退、消除或改善肝内胆汁淤积[68]。
1.6.1.4 抗癌作用
目前研究者普遍认为，cAMP 可以引起癌变细胞膜通透性的改变，正常的细胞可以在血清因子的调节下控制细胞膜使营养物质进入细胞内得到控制从而抑制其生长繁殖，而癌细胞 cAMP 水平下降使细胞膜不再受血清因子的制约，使得营养物质不断进入细胞内使细胞过度增殖；而且癌细胞膜生化改变，导致 cAMP 水平降低，从而促进细胞分裂而产生癌变[69,70]。医学临床上，通常把 cAMP 用于急性白血病的诱导缓解，且与化学疗法结合使用可提高急性白血病的治疗疗效。
功能性食品是指具有特定保健功能或者以补充维生素、矿物质为目的的食品， 即适宜特定人群食用，具有调节机体功能，不以治疗疾病为目的，并且对人体不产生任何急性、亚急性或慢性危害的食品[71]。
1.6.1.4 开发富含 cAMP 的功能性食品的价值
cAMP 作为激素的“第二信使”，在细胞内可以通过激素调节机体生理机能和物质代谢。对心脏起到正性肌力、营养心肌、舒张血管、抗心律失常和抗血小板凝聚的作用。此外，它还对糖、脂肪代谢、核酸、蛋白质的合成调节等起着重要的作用。
目前，对开发富含 cAMP 的功能性食品的报道还不多，但是随着 cAMP 工艺的不断改进和优化、cAMP 需求量的增加以及人们对养生健康的重视，对富含 cAMP 的功能性食品的研制逐渐成为热点问题。
1.6.1.4 富含 cAMP 的功能性食品发展前景
功能性食品的相关产品开发越来越具有针对性，分类也越来越精细。各个功能性
品的生产企业也越来越关注针对不同人群而开发具有针对性的功能性产品。比如根据个人性别、年龄、饮食状况、健康状况还有生理活跃水平的不同， 提供具有针对性的营养健康解决方案。并且开发的功能食品之功效也更具有针对性更加具有专一性，保健效果也越来越明显[72]。
中国地大物博，有着丰富的药食同源性植物资源。比如银杏灵芝、人参罗汉果、郁李仁、金银花、红枣等珍贵植物， 使这些药食同源的食材的功能效果得到大家广泛认可，研究其中的功能性因子，直接以这些原料开发功能性食品，或者提取其中的功能性成分，添加到其他食品中开发出新的功能性产品[73]。
随着人们生活节奏的加快，由于生活压力的增大和饮食结构的不合理，患肥胖症、冠心病、糖尿病等疾病的人也越来越多， 人群的亚健康问题尤为突出。于此同时人民的购买力和健康意识也越来越强，人们也越来越注意养生和保健。在此背景下， 功能性食品必将越来越受到广大消费者的欢迎。我国社会经济的飞速发展， 也为广大消费者的购买能力提供了强大经济保证[74]。
综上所述，今后一段时期将会是功能性食品发展的黄金时期，功能性食品必将在促进全民身体健康方面有着巨大的发展空间并发挥着越来越重要的作用。开发富含cAMP 的功能性食品有着巨大的经济潜力和市场价值。同时为枣的综合利用和功能食品的开发提供新途径，推动我国农副产品深加工的发展。
1.7.2 课题研究意义
由于 cAMP 的特殊生理活性作用，而且其在红枣中含量较高，所以对红枣中 cAMP的分离纯化及对 cAMP 进行深度加工有着巨大的经济潜力。也为红枣的开发和利用提供了另外一个新的途径。
一般用来生产 cAMP 的化学合成法和微生物发酵法都具有一定的局限性。化学合成法对环境有污染，合成过程中使用的溶剂有一定得毒性，会残留在人体，不利于健康。微生物发酵法受菌种限制的影响而较难分离。由于以上方法的局限性， 人们将着眼点逐步转向从来源丰富的天然原料中提取。有研究表明枣类中含有相对较高的cAMP，所以关于从枣类中分离纯化出 cAMP 的研究成为了新的研究热点。
从红枣中提取的天然 cAMP，可以作为研发功能性食品添加剂和医药原料药。开发富含 cAMP 的口服液等功能性食品，为枣的综合利用和功能食品的开发提供新途径，推动我国农副产品深加工的发展。从天然生物中提取 cAMP，它所具有的优势是其它合成产品不能替代的。为了进一步为红枣的开发利用提供高的附加值，需要对红枣中的 cAMP 的提取、纯化进行更有效的研究。争取能更早有效的应用到实际中，进行工业化生产。
在实际检测中，红枣提取液通过团体标准检测，环磷酸腺苷每百毫升≥25毫克。
