环磷酸腺苷和一氧化氮在后适应保护缺氧/复氧损伤心肌细胞中的作用

环磷酸腺苷和一氧化氮在后适应保护缺氧/复氧损伤心肌细胞中的作用☆

王  茜1 ，刘革修2，宾  娟1 ，徐江平1

0    引言                                  

心肌缺血后适应指心肌缺血后长时间的再灌注之前，进行一次或数次短暂重复的心肌缺血/再灌注，能提高心肌对之前发生的较长时间缺血的耐受性[1]。现已有多个独立研究在多个种系的动物实验中得到了证明[2-5]。但临床应用缺血心肌缺血后适应技术可能会导致潜在的并发症，如粥样斑块破裂或引起远端血栓栓塞。有学者提出通过使用模拟内源性机制的药物来发挥心肌缺血后适应的保护作用，因而需要对心

肌缺血后适应的机制进行研究。

第二信使环磷酸腺苷(cyclic  adenosine monophosphate, cAMP)参与心脏广泛的细胞功能和形态学过程，包括心肌变力状态、变时性、凋亡和肥大的调节过程，且cAMP功能异常在心力衰竭和心肌病中起着一定的作用。另一方面，心内膜和心肌细胞产生的NO是调节心功能的重要递质之一，其在心肌缺血中的作用受到高度重视。本实验观察信号分子cAMP和NO在心肌缺血后适应保护培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/Reoxygenation,  H/R)损伤时的作用及可能机制。

ISSN 1673-8225   CN 21-1539/R     CODEN: ZLKHAH                                                                                                                                               5277

1  南方医科大学药学院神经药理课题组，广东省广州市  510515；2   暨南大学医学院血液病研究所，广东省  广  州  市510632

王茜☆, 女，1974年生，湖南省益阳市人，汉族，南方医科大学在读博士，主要从事心血管药理学研究。 wangqian86@

hotmail.com

通讯作者：徐江平，教授，博士生导师，南方医科大学药学院神经药理课题组，广东省

广州市 510515

jpx@fimmu.com

中图分类号:R318

文献标识码:B

文章编号:1673-8225

(2011)28-05277-04

收稿日期 2011-04-01修回日期：2011-05-02

(20110401008/GW ·S)

1   材料和方法

设计：对比观察细胞学实验。

时间及地点：于2010-05/12在南方医科大学药学院神经药理科完成。

材料：

实验动物：新生1~3 d清洁级SD大鼠，雌雄不拘，购自南方医科大学医学院实验动物中心，许可证号：粤检证字第2006-0015号。

试剂与药品： MTT、腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536 、一氧化氮供体左旋精氨酸、非选择性一氧化氮合酶抑制剂N⑴-硝基-左旋精氨酸(N⑴-nitro-L-arginine，L-NAME) ，特异性PDE4抑 制 剂 咯 利 普 兰 均 为 Sigma 公 司 产 品 ； DNase Ⅰ , Roche公司产品；乳酸脱氢酶、肌酸激酶和NO测试盒，南京建成生物工程研究所。

实验方法：

乳鼠心肌细胞原代培养：消毒后开胸取出2 d龄乳鼠心脏，于冰PBS中冲洗后剪成数块。将组织碎块移至小锥形瓶中，0.1%胰蛋白酶冷消化预处理20min。磁力搅拌器上水浴消化5 min左右，吹打后自然沉降，第1次上清弃去。补足消化液并加0.05 g /L DNase Ⅰ ,重复消化、吹打、自然沉降，吸走上清，离心后弃上清、重悬细胞。剩余未消化的组织块继续加入酶消化，重复上述过程，直至剩余少许组织块为止。将各次重悬的细胞液再次800~1  000  r/min离心5 min，弃上清、重悬细胞后接种于培养瓶中， 37 ℃培养1.5 h，差速贴壁分离获得心肌细胞，锥虫蓝染色判断细胞存活率，根据要求调整细胞浓度后接种于培养皿或板内[6]。

实验方案及分组：将心肌细胞分组培养。正常对照组，高糖DMEM、体积分数5%CO2 和95%O2 持续培养9.0~10.0  h 。 H/R 组， 低糖DMEM、体积分数5%CO2和95% N2培养3 h后，恢复高糖DMEM、体积分数5%CO2和95%O2继续培养6 h；后适应组，低糖DMEM、体积分数5%CO2 和95%  N2 培养3  h，继以3个循环的5  min/5  min  H/R后适应处理，然后恢复高糖DMEM、体积分数5% CO2和95 % O2继续培养6 h；后适应+咯利普兰组，氧、糖剥夺前1 h以1，5，10 μmol/L咯利普兰处理，之后同后适应组；后适应+SQ22536组，氧、糖剥夺前1 h以500 nmol/L SQ22536处理，之后同后适应组； H/R+SQ22536或咯利普兰组，氧、糖剥夺前

1   h 以 10   μmol/L 咯 利 普 兰 或 500   nmol/L SQ22536处理，之后同H/R组；后适应+L-精氨酸组，氧、糖剥夺前1 h以1 mmol/L的L-精氨酸处理，之后同后适应组；H/R+L-NAME组，氧、糖剥夺前1  h以20 ，100 ，1  000  μmol/L  的L-NAME处理，之后同H/R组。

细胞外乳酸脱氢酶、肌酸激酶活性和一氧化氮水平检测：各组分别干预后恢复正常氧糖继续培养6 h至实验结束，取细胞培养液500 μL，用南京建成各试剂盒检测。

细胞增殖的测定：采用MTT法测定各组细胞吸光度值(A值)，计算心肌细胞活力。

Total RNA抽提及Real time-PCR：用Trizol试剂提取总RNA，取3μg反转录合成cDNA 。 应用Primer5.0引物设计软件进行引物设计。各基因引物序列如下： β-actin ， F:  5’-AGA GGG AAA TCG TGC GTG AC-3'，R: 5’–CCA TAC CCA  GGA  AGG  AAG   GCT3’； CREB ， F:5’CCA CAA GTC CAA ACA GTT CAG TCT TC3’，R: 5’TGG TGA TGG CAG GGG CTGA AGT3’； iNOS ，F:  5’GTG  GCG  ATG  TGC GCA TGG CT3’；R: 5’TGG TTC ATT TTC CTC TGC TCT CAG CT3’；IL-1β , F：5’TGA GGC TGACAGACC CCAAAA GAT3’，R：5’ GCT CCA CGG GCAAGA CATAGG TAG3’； TNF-α , F：5’AAA TGG GCT CCC TCT CAT CAG TTC3’，R：5’TCT GCT TGG TGG TTT GCT ACG AC3’。用OligodT(18)  引物反转录获得总cDNA，实施实时荧光定量PCR反应。以△Ct表示目的基因与β-actin Ct值的差值、 △△Ct表示对照组与处理各组△Ct的差值，以及以2-△△Ct反应目的基因 mRNA  的相对含量进行分析。

主要观察指标：各组心肌细胞活力、培养液乳酸脱氢酶和肌酸激酶活性、一氧化氮水平及急性炎症因子mRNA的表达。

统计学分析：数据由第一作者采用SPSS

13.0软件完成统计处理。结果采用x__±s表示，组

间显著性检验采用单因素方差分析和LSD检验。

2   结果

2.1   心肌缺血后适应及各工具药对H/R心肌细胞活力的影响  与正常对照组相比，H/R显著

5278                                                                                                                 P.O. Box 1200, Shenyang      110004      cn.zglckf.com

降低心肌细胞活力，而缺血后适应能显著改善心肌细胞活力。SQ22536则能显著减弱缺血后适应对心肌细胞的作用，而特异性PDE4抑制剂咯利普兰则能显著增强该作用(P均< 0.05)。而左旋精氨酸则对缺血后适应的作用无影响。20 ，100  μmol/L  L-NAME能显著增强心肌细胞活力，而1 000  μmol/L则反而显著降低心肌细胞活力(P < 0.05)，见表1。

2.2    心肌缺血后适应及各工具药对心肌细胞乳酸脱氢酶和肌酸激酶释放的影响  H/R显著增加心肌细胞乳酸脱氢酶和肌酸激酶的释放，而缺血后适应则显著减少两酶的释放。SQ22536则能显著减弱缺血后适应对该两酶释放的降低作用， 而咯利普兰则能显著增强该作用(P 均< 0.05)。左旋精氨酸对缺血后适应减少两酶释放的作用无影响；20  μmol/L  L-NAME能显著减少心肌细胞乳酸脱氢酶和肌酸激酶的释放(P< 0.05)，而在100， 1 000 μmol/L时则无明显影响，见表2。

2.3    心肌缺血后适应及各工具药对心肌细胞NO释放的影响  H/R能显著增加心肌细胞培养液中NO的含量，

而缺血后适应能使其显著减少。SQ22536则能显著减弱缺血后适应对NO含量的降低作用，而咯利普兰则能显著增强该作用(P均< 0.05)。左旋精氨酸能增加培养液中NO含量；L-NAME能显著抑制H/R导致的NO释放(P均< 0.05)，见表3。

2.4    心肌缺血后适应及各工具药对心肌细胞急性炎症因子mRNA表达的影响  与正常对照组相比，H/R组心肌细胞急性炎症因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的mRNA表达显著增高，而缺血后适应处理能使其显著降低。SQ22536则能显著减弱缺血后适应的该作用，咯利普兰则显著增强缺血后适应的该作用(P < 0.05) 。20，和100  μmol/L  L-NAME可显著降低心肌细胞肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β mRNA表达(P< 0.05)，见表4。

3   讨论

cAMP和NO为心功能调节的重要信号分子。一方

面，有研究发现周期性的cAMP 浓度改变参与了预适应对缺血心脏的保护作用[8] ，并且活化腺苷酸环化酶/ cAMP通路的药物能引出缺血心肌的延迟保护作用[9] 。实验结果显示，抑制cAMP水解的PDE4抑制剂咯利普兰，能增强缺血后适应对H/R所致心肌细胞活力增加、乳酸脱氢酶和肌酸激酶释放减少作用，而抑制cAMP生成的腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536发挥与之相反的作用，说明cAMP参与了缺血后适应对H/R心肌细胞的保护作用。另一方面，NO对缺血/再灌注损伤心肌也有着十分重要的作用，但其作用一直存在“保护作用”和“毒性作用”两种矛盾观点[10-14]。

缺血再灌注早期，多种细胞因子可上调巨噬细胞等内源性的一氧化氮合酶的mRNA表达，并产生大量的NO；过量的NO与氧迅速反应生成大量的氧自由基，损害心肌细胞和血管，从而加重心功能损伤[15]。但它又能扩张冠脉、抑制血小板和白细胞黏附[16]、抑制平滑肌细胞增殖，在心肌缺血再灌中发挥着保护作用[17]。实验结果显示后适应能抑制H/R导致的心肌细胞NO释放过多，发挥保护作用，且非选择性一氧化氮合酶抑制剂L-NAME在低浓度时也表现出与后适应相似的作用。但NO供体左旋精氨酸并不能增强后适应的保护作用，且高浓度的L-NAME并不保护心肌细胞的H/R损伤，也证明了NO的双向性作用：较低浓度时发挥保护作用，较高浓度则为损伤作用。而缺血后适应在较低浓度范围内增加NO，表现出保护作用。该结果与前人对心脏收缩性的影响研究一致：NO增加心肌收缩性，而高浓度的NO则产生负性肌力作用。

缺血再灌注被认为是一多因素参与、非抗原依赖性的炎症反应过程。有不同研究在动物心缺血/再灌模型或细胞缺氧/复氧模型发现了肿瘤坏死因子α表达增高的心肌炎症反应。也有研究报道在人心脏骤停后复苏(缺血/再灌状态)、在立即再灌注阶段其血浆中肿瘤坏死因子α浓度急剧上升，随后白细胞介素1β也升高，并且肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的峰值发生在左室功能障碍的最低点。基于以上认识，作者检测了缺血后适应对两个急性炎症因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的作用。结果显示缺血后适应能降低该两炎症因子的表达；而咯利普兰能增加缺血后适应对它们的作用，SQ22536则能降低该作用。故缺血后适应可通过增强cAMP信号分子而抑制炎症过程。另一方面，左旋精氨酸对缺血后适应降低该两炎症因子表达的作用并无影响，可能由于还存在其他信号通路参与调节。而L-NAME在较低浓度时降低H/R所致心肌细胞炎症因子的表达，高浓度则不能。同样也体现了NO的双向性作用：适度时发挥保护作用，如缺血后适应处理或与咯利普兰合用，以及较低浓度L-NAME轻度抑制一氧化氮合酶时；NO合成过少也不

利，如高浓度L-NAME显著抑制一氧化氮合酶时并不能保护心肌细胞、抑制急性炎症因子的表达。所以NO信号分子也参与了缺血后适应对炎症因子的调节作用。

实验证实了缺血后适应对H/R损伤心肌细胞的保护作用，且机制可能是通过增强cAMP信号分子抑制炎症过程，NO信号分子在其中也发挥一定的作用。

红枣提取液的环磷酸腺苷每百毫升≥25毫克